[发明专利]辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法

说明书

本发明提供辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法，属于植物病毒检测领域，其采用了两个引物对CP337‑F/CP337‑R、CI655‑F/CI655‑R，建立基于ChiVMV外壳蛋白（CP）与细胞质内含体（CI）两个基因的多基因联合检测体系。该方法不仅具有良好的特异性，而且灵敏度与单一RT‑PCR的灵敏度相当，均为10^‑4数量级，显示出良好的检测灵敏度。本发明建立的多基因联合检测体系能在一个反应中同时检测出ChiVMV的CP及CI基因保守区片段，可以满足口岸进出境和农业生产上辣椒脉斑驳病毒的快速、准确检测需求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法。

背景技术

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物，原产于中南美洲热带地区，在世界范围内广泛种植。在我国，辣椒种植面积高达140 hm²以上，约占我国所有蔬菜种植面积的10%。病毒病是辣椒作物上的一类重要病害，严重影响辣椒作物的品质和产量，目前世界各地陆续报道的辣椒病毒有70种以上，而我国发现至少有37种，其中辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus, ChiVMV）是辣椒上重要病毒之一，其传播速度快且危害大，侵染辣椒能造成严重的经济损失。ChiVMV是一种正义单链RNA病毒，属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，其基因组全长约9711个核苷酸，粒体形态呈弯曲线状。该病毒最早是1979年于马来西亚被报道，在我国最早发现于海南的黄灯笼椒上，随后在陕西、云南、福建、湖南等地区被发现并报道。ChiVMV侵染辣椒的典型症状为叶脉呈暗绿色条纹，叶片皱缩、畸形，植株矮小，结果前落花落果，仅留下少量杂色畸形果。该病毒的自然寄主主要为辣椒、番茄等茄科作物，自然条件下主要依靠蚜虫进行非持久性传播。除此之外，ChiVMV还可以通过机械传播和汁液传播，但不能通过种子传播。由于该病毒常与其他病毒复合侵染，且不同病毒侵染后症状也较为相似，因此建立一种可靠、高效的检测鉴定方法显得尤为重要。

近年来，国内外关于ChiVMV的研究报道越来越多，且已有多种成熟的技术用于该病毒的检测与鉴定，如Ravi等利用电镜对提纯后的病毒进行观察首次报道了该病毒粒体形态；Siriwong等通过对该病毒泰国分离物的血清学研究，发现其与ChiVMV分离物抗血清存在强烈的阳性反应；Moury 等根据不同辣椒病毒的核内含体蛋白b（Nuclear inclusionbody protein,NIb）及外壳蛋白（Coat protein, CP）基因序列相互比较并设计引物，通过RT-PCR的特异性片段区分了ChiVMV与其他辣椒病毒；唐前君等通过建立能够同时检测包含ChiVMV等4种辣椒病毒的四重RT-PCR检测体系，提高了辣椒病毒病复合侵染的检测效率；汤亚飞等^]依据CP基因设计了能检测ChiVMV的RT-LAMP引物，建立了ChiVMV的RT-LAMP检测体系，后又利用小RNA深度测序及RT-PCR的方法鉴定了包括ChiVMV在内侵染广东省辣椒的8种病毒。由于Potyvirus的不同病毒之间可能存在非常高的亲缘关系，无法实现ChiVMV的快速、准确检测与鉴定。例如ChiVMV与甜椒脉斑驳病毒 （Pepper veinal mottle virus,PVMV）之间在系统发育上亲缘关系非常近，且两者CP基因的C末端有一段长204个氨基酸的保守区，序列一致性超过90.2%，应用传统的血清学容易产生交叉反应。因此生产上建立一种基于多基因联合快速、准确检测ChiVMV的方法尤为迫切。