[发明专利]一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用

说明书

本发明提供一种一步式RPA‑CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用。所述核酸检测方法包括如下步骤：将待测溶液、RPA试剂和CRISPR试剂混合并扩增，同时检测扩增过程中反应体系的实时荧光强度，实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。本发明中将待测溶液、RPA试剂和CRISPR试剂混合，使扩增和检测同步进行，操作步骤简单，耗时较短，且所述检测方法具有高灵敏度和高特异性，其能够检测到浓度为1aM的目标DNA。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

核酸扩增技术可使核酸的检测灵敏度达到埃摩(aM)级别，在实际样品的检测应用中具有非常重要的价值。目前PCR是核酸检测的金标准，但是其所需要的变性-复性-延伸三阶段程序控温极大的增加了检测设备的制作成本，且其检测耗费时间通常超过1h。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被称作是最有可能替代PCR的核酸扩增技术，仅仅需要在恒定的37～40℃内保持10-15min即可实现核酸的快速扩增，在实际的快速现场检测需求中具有广阔的应用前景。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。

CRISPR技术是近两年发现的核酸快速检测技术，主要是依靠荧光信号来判定检测样品中靶标核酸分子的浓度，其发现者Janice S.Chen认为CRISPR-Cas12a作为一种强有力的工具可用于各种来源的DNA的检测(详见Chen J S,Ma E,Harrington L B,etal.CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-strandedDNase activity[J].Science,2018,360(6387):436-439.)。

研究者还发现CRISPR-Cas12a技术具有非常高的特异性，甚至crRNA与目标DNA单个碱基的错配就会导致信号强度的巨大差异，即CRISPR-Cas12a可实现单碱基差异的分辨率，但单一的CRISPR-Cas12a技术其检测灵敏度仅为pM-nM级别。

目前，已有通过PCR或LAMP进行核酸扩增，再利用CRISPR检测的方法，即首先利用PCR或LAMP进行核酸扩增，然后再将扩增产物加入CRISPR体系进行检测(详见Li Y,MansourH,Wang T,et al.Naked-Eye Detection of Grapevine Red-Blotch Viral InfectionUsing a Plasmonic CRISPR Cas12a Assay.[J].Analytical Chemistry,2019,91(18):11510-11513.；Li L,Li S,Wu N,et al.HOLMESv2:A CRISPR-Cas12b-Assisted Platformfor Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation[J].ACS SyntheticBiology,2019,8(10):2228-2237.)。

上述方法带来的问题包括：1、在扩增产物的转移过程中有造成气溶胶污染的风险，在实际检测中很容易出现假阳性结果；2、扩增完成后，核酸样本浓度基本一致，再次进行CRISPR检测无法实现定量化等。

因此，提供一种灵敏度和准确度较高、不易被污染的核酸定量化分析方法是本领域亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用，所述RPA-CRISPR核酸检测方法能够一步实现目标DNA的扩增和检测，使扩增和检测同步进行，不仅去除了扩增产物转移带来的污染问题，而且能够实时反应扩增过程，具有定量分析能力。