[发明专利]一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用在审
| 申请号： | 202010679764.3 | 申请日： | 2020-07-15 |
| 公开（公告）号： | CN111808931A | 公开（公告）日： | 2020-10-23 |
| 发明（设计）人： | 蒋兴宇;陈勇 | 申请（专利权）人： | 南方科技大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 潘登 |
| 地址： | 518055 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 一步 rpa crispr 核酸 检测 方法 试剂盒 应用 | ||
1.一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测溶液、RPA试剂和CRISPR试剂混合并扩增，同时检测扩增过程中反应体系的实时荧光强度，实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述扩增的温度为26～42℃，优选为37～42℃；
优选地，所述扩增的时间为20～90min，优选为45～90min。
3.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述RPA试剂中包括DNA重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP、RPA正向引物和RPA反向引物；
优选地，所述CRISPR试剂中包括Cas12a、crRNA和探针DNA。
4.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于，所述RPA正向引物的工作浓度为0.3～0.8μM，优选为0.5μM；
优选地，所述RPA反向引物的工作浓度为0.3～0.8μM，优选为0.5μM；
优选地，所述RPA正向引物的长度为25～40bp，优选为30～35bp；
优选地，所述RPA反向引物的长度为25～40bp，优选为30～35bp。
5.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于，所述Cas12a的工作浓度为0.01～0.05μM，优选为0.025μM；
优选地，所述crRNA的工作浓度为0.1～0.5μM，优选为0.25μM；
优选地，所述探针DNA的工作浓度为0.1～0.2μM，优选为0.12μM。
6.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于，所述探针DNA的两端修饰有荧光基团和荧光猝灭基团；
优选地，所述荧光基团包括HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA或FAM中的任意一种；
优选地，所述荧光猝灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGBNFQ中的任意一种。
7.根据权利要求1～6任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述核酸检测方法包括如下步骤：
(1)配制反应体系：将DNA重组酶、DNA聚合酶、dNTP、RPA正向引物、RPA反向引物、Cas12a、crRNA和探针DNA混合，再与待测溶液混合得到所述反应体系；
其中，所述RPA正向引物的工作浓度为0.2～0.8μM，所述RPA反向引物的工作浓度为0.2～0.8μM，所述Cas12a的工作浓度为0.02～0.03μM，所述crRNA的工作浓度为0.1～0.5μM，所述探针DNA的工作浓度为0.1～0.2μM；
(2)扩增并检测：所述反应体系在37～42℃扩增20～90min，并通过荧光实时定量检测仪检测荧光强度，实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
8.一种利用如权利要求1～7任一项所述的核酸检测方法进行核酸扩增和检测的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA试剂、CRISPR试剂和阳性标准品。
10.如权利要求1～7任一项所述的核酸检测方法或如权利要求8或9所述的试剂盒在传染病监测、检验检疫、食品安全或毒品检验中的应用。
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