[发明专利]一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，提供了一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用，以I型鸭肝炎病毒及鸭脾脏为模板，通过RT‑PCR分别获得VP1和IL‑6基因，连接至PMD18‑T载体后保存备用；利用重叠延伸PCR技术得到VP1‑IL6融合基因，融合基因经双酶切后连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转座子，获得pPIC9‑VP1‑IL6阳性菌株；将表达产物添加LPS后与白油佐剂乳化后制作疫苗后免疫蛋鸡，制备卵黄抗体；本发明成功克隆DHV‑I的VP1及鸭IL‑6基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，融合蛋白制备的卵黄抗体保护效果好，具有抗病毒和消炎双重作用。

技术领域

本发明涉及家禽疫病免疫控制领域，涉及一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用，更为具体的涉及一种pPIC9-VP1-IL6重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种高度致死性传染病。临床上以具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征，其主要侵害6周龄以内雏鸭，尤以2日至3周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。随着近几年中国养鸭业快速发展，该病已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭肝炎病毒包含小核糖核酸病毒科、星状病毒科、嗜肝病毒科3个病毒科的4种病毒，其中小核糖核酸病毒科的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)呈世界性分布，毒力最强，感染率最高，危害也最严重。I型鸭肝炎病毒的发生和传播很快，雏鸭感染主要表现为精神萎靡、缩颈、翅下垂、厌食。患病鸭出现神经症状，角弓反张。大量死亡常在3-5d内发生。剖检病变主要集中在肝脏，表现为肝脏肿大、质脆易碎等现象，肝脏颜色暗淡或发黄，表面呈斑驳状；另外，胆囊、脾脏、胰腺等脏器也出现病变。

由于该病主要危害雏鸭，而20日龄以内的雏鸭的免疫系统还未发育完全，对雏鸭进行疫苗免疫效果通常不理想，所以对本病最常用的防制方法是用疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体，从而预防该病。然而，由于种鸭免疫不及时、不规范，或者病毒变异造成雏鸭母源抗体水平不高或者中和效果变差等原因造成了临床发病率居高不下。目前商品代肉鸭普遍在3-4日龄时接种卵黄抗体以预防该病，或者在发病早期紧急接种卵黄抗体进行治疗。然而，临床反应注射精制卵黄抗体治疗时常常出现效果不理想的案例。研究发现，鸭肝炎病毒感染急、发病快，感染0.5-1d即可诱导大量的炎性细胞因子表达，造成“细胞因子风暴”，这是雏鸭大批死亡的重要原因。然而，目前的卵黄抗体成份主要为针对鸭肝炎病毒的特异性抗体，即使可以中和病毒，但是并没有消除炎症，对于发病高峰期鸭群中的重症雏鸭依然会快速死亡，这是临床上治疗鸭病毒性肝炎失败的主要原因。因此，如何有效降低雏鸭体内的炎症反应是提高抗体治疗效果的有效解决方法。

炎性细胞因子是一类主要由免疫系统细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，可介导多种免疫反应。炎性细胞在体内过度表达可引起多器官衰竭的症状。研究发现，鸭肝炎病毒感染雏鸭后会诱导多种细胞因子表达量升高，包括IFN-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α等，其中IL-1β、IL-2、IL-6为促炎细胞因子，可以诱导严重的炎症反应。是否抑制这些细胞因子的活性就能够降低鸭体内的炎症反应的强度尚无相关研究，通过何种方式抑制，且抑制哪一种细胞因子活性的治疗效果最佳并不清楚。

因此能否提供一种解决上述鸭肝炎病毒抗体水平不高，同时能够有效降低雏鸭体内的炎症反应的技术方案，成为本领域的技术难题。

发明内容