[发明专利]一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.pPIC9-VP1-IL6 重组质粒，其特征在于：该重组质粒中含有VP1-IL6融合基因，该基因的序列如SEQ ID NO：5所示。

2.重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

① I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：

提取I型鸭肝炎病毒标准株RNA反转录为cDNA，将其作为模板，以引物Primer 1和2，其基因序列如SEQ ID NO：6 和7所示，进行 PCR扩增VP1基因， PCR产物胶回收，VP1基因序列如SEQ ID NO：1所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-VP1，保存备用；

② 以①中构建的质粒为模板，设计引物Primer 3和4，其基因序列如SEQ ID NO：8和9所示，上游引物Primer 3引入Xho I酶切位点序列和HIS标签序列，下游引物Primer 4中引入linker序列，PCR扩增得到VP1-Linker，其基因序列如SEQ ID NO：2所示；

③ 鸭 IL-6基因的PCR扩增：提取鸭脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增鸭 IL-6基因，所用引物为Primer 5和6，其基因序列如SEQ ID NO：10 和11所示；PCR反应扩增鸭IL-6基因并胶回收后，鸭IL-6基因的CDS序列如SEQ ID NO：3 所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-IL6，保存备用；

以③中构建的质粒为模板，设计引物Primer 7和8，其基因序列如SEQ ID NO：12 和13所示，上游引物Primer 7的起点为去除信号肽的IL-6序列，并在引物中引入linker，下游引物Primer 8中引入Not I酶切位点序列，PCR扩增得到鸭 IL-6-linker基因，其基因序列如SEQ ID NO：4所示；

分别胶回收VP1-linker及IL-6-linker基因PCR扩增产物作为模板，以Primer 3 ，其基因序列如SEQ ID NO：8 所示和Primer 8，其基因序列如SEQ ID NO：13 所示为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到VP1-IL6融合基因其基因序列如SEQ ID NO：5 所示;

④将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接至PMD18-T载体质粒，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒;

⑤将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述Xho I和Not I限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化和酶切验证已连接，然后经质粒测序验证插入的外源基因序列正确，质粒命名为：pPIC9-VP1-IL6。