[发明专利]一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用

说明书

本发明公开了一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用，属于细胞模型构建领域。本发明采用电穿孔法将CRIPSR‑Cas9基因编辑系统转入iPSC；将含有Puromycin抗性基因和GFP基因的Donor DNA插入NANS外显子，通过Puromycin对基因编辑后干细胞进行筛选；转染后加入CloneRsupgt;TM/supgt;培养细胞，该体系可以大大提高CRISPR‑Cas9基因组编辑技术在干细胞中的基因编辑效率。本发明将有助于构建NANS缺陷型的3D大脑类器官模型，可应用于基于NANS突变引起的智力发育障碍发病机制的体外研究和药物研发。

技术领域

本发明涉及细胞模型构建领域，具体涉及一种基于CRISPR-CAS9基因编辑技术敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用。

背景技术

智力发育障碍(Intellectual developmental disorders，IDD)，又称为智力低下、精神发育迟滞C Mental Retardation,MR)，是一组以18周岁前起病，认知功能障碍(IQ值70分)，社会适应能力缺陷为特征的疾病。在学龄前(5岁以下)则表现为语言能力及运动发育迟缓等，又被称为精神发育迟缓(Developmental Delay,DD)。综合征型的智力障碍通常还伴有先天多发畸形(Multiple congenital anomalities,MCA)、特殊面容等。ID/DD的病因复杂，包括环境因素，围产期缺氧及遗传因素，其中遗传性因素占2/3。目前，由于对IDD的发病机制知之甚少，IDD的治疗还十分困难，因此，建立IDD研究和药物评价模型对推动IDD的治疗进展至关重要。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用该平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。大脑类器官是细胞定向诱导分化形成的大脑皮质结构，可一定程度上在体外模拟人类胚胎早期大脑的发育过程和结构特点，并能较好地保持人体特异性基因型和蛋白表达水平，在研究精神疾病的起源和病理学、药物筛选和基因改造方面具有很大潜力。与传统动物研究模型相比，人大脑类器官的出现，缩小了动物大脑与人类大脑物种差距，并为精神疾病的体外研究提供了新的工具。

NANS，也称为唾液酸(磷酸)合酶(SAS)，负责编码N-乙酰神经氨酸9-磷酸合酶(NeuNAc-9-P合酶)，该酶在最常见的唾液酸——N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的初级合成中起关键作用。此外，作为主要唾液酸化底物CMP-Neu5Ac产生途径的关键步骤，NANS还可以影响聚糖的唾液酸化，该修饰可以介导或调节多种生理和病理过程，例如脊椎动物胚胎神经系统的正确建立，炎症和免疫反应途径，某些癌症中的肿瘤发生和转移。最近，有临床研究表明NANS中的双等位基因突变与智力发育障碍(IDD)有关，但机制尚不清楚。通过CRISPR-CAS9技术建立NANS缺陷细胞系，并将该细胞系分化成为大脑类器官，有望建立基于NANS突变引起的智力发育障碍体外疾病模型，以便深入探究基于NANS突变引发智力发育障碍的发病机制，并为携带NANS基因突变的智力发育障碍的患者提供药物筛选工具。

目前尚未见构建基于NANS缺陷大脑类器官的智力发育障碍模型的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：一种基于CRISPR-CAS9基因编辑技术敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种sgRNA，其识别序列为TCTCGGCAATGATGAAGCAC。

一种利用CRISPR-CAS9技术敲除iPSC细胞中NANS基因的方法，其特征在于：sgRNA识别序列为TCTCGGCAATGATGAAGCAC。

术语“sgRNA识别序列”指：sgRNA所识别的基因组片段的序列。