[发明专利]一种敲除诱导多能干细胞NANS基因的方法和应用

权利要求书

1.一种利用CRISPR-CAS9技术敲除iPSC细胞中NANS基因的方法，其特征在于：sgRNA识别序列为TCTCGGCAATGATGAAGCAC；所述方法包括如下步骤：

1）将sgRNA-cas9 质粒和线性Donor DNA转染iPSC，培养，筛选成功转染的阳性iPSC；所述转染为电转，电转的条件为：电压1100V，脉冲宽度30 ms，脉冲次数1次;

2）挑取阳性iPSC克隆，通过PCR、测序或蛋白检测进行验证；步骤1）所述sgRNA-cas9 质粒携带sgRNA和Cas9基因；

步骤1）所述Donor DNA的序列为如SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：电转使用neon®转染系统，电转缓冲液为Ebuffer。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）电转结束后，将细胞加入到含10%CloneR™的mTeSR™1培养基中进行培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中PCR的引物序列如SEQ ID NO: 9~12所示，其中SEQ ID NO: 9~10为鉴定野生型的引物；SEQ ID NO: 11~12为鉴定突变型的引物。

5.权利要求1~4任一方法制备得到的细胞。

6.一种制备NANS敲除的大脑类器官的方法，其特征在于：它是用权利要求5所述的细胞诱导分化出大脑类器官。