[发明专利]一种基于蛋白互作原理的编码线粒体磷转运蛋白基因的筛选方法

说明书

本发明提供一种基于蛋白互作原理的编码线粒体磷转运蛋白基因的筛选方法，属于基因工程技术领域，包括通过构建的番茄cDNA文库与诱饵蛋白基因酵母表达载体共转化到酵母、培养，得到菌斑，菌斑在含有X‑gal的培养基上培养，挑取蓝色菌斑，PCR检测，得S1GPI基因互作的基因序列，经酵母双杂交系统互作和双分子荧光互补分析验证，得到S1GPI基因与S1PHT3基因互作；以S1GPI基因为诱饵，筛选冰叶日中花cDNA文库，经酵母双杂交系统互作分析和双分子荧光互补验证分析，得与S1GPI基因互作的冰叶日中花线粒体转运蛋白基因。本发明减少时间，增强分离出基因的可信性，为快速目标基因的分离提供简便易行的有效途径。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于蛋白互作原理的编码线粒体磷转运蛋白基因的筛选方法。

背景技术

依据基因序列和功能的同源进化远近，将动植物以及微生物研究知道的与磷吸收转运有关的转运体分为六大家族：Pht1、Pht2、Pht3、Pht4、Pho1和Pho2(Liu et al.,2012；Okumura et al.,1998)。第一个高亲和力磷转运蛋白基因是从酵母中分离得到的(Bun-Yaet al.,1991)。通过利用酵母中的高亲和力磷转运蛋白基因PHO84为探针，前人从拟南芥中克隆到两个磷转运蛋白基因(Muchhal et al.,1996)。此后，在马铃薯、番茄、水稻、烟草、小麦、大麦、苜蓿等高等植物中克隆到多个相似的磷转运蛋白基因(Goff,2002；Mudge etal.,2002；Rae et al.,2003；Schunmann et al.,2004)。随着多种植物基因测序工作的相继完成，研究发现植物基因组中存在多组磷转运蛋白基因。植物中PHT1家族的磷转运蛋白大多属于高亲和力磷转运蛋白(Muchhal et al.,1996)。Pht1家族基因的蛋白主要定位于根系细胞膜上，土壤中可溶性磷主要由这类蛋白负责吸收来满足植物需求(Ming et al.,2005；Rausch et al.,2004)；Pht2家族基因的蛋白主要定位于细胞质体内膜上，负责将细胞质中的无机磷转入质体(Versaw,2002)；Pht3家族基因的蛋白主要定位于线粒体膜上，线粒体内的磷的交换由它们负责(Poirier and Bucher,2002)。Pht4家族基因的蛋白主要定位于高尔基体膜上，地上部分绿色组织中磷的运输由它们来负责(Daram et al.,1999；Karthikeyan,2002)。其中，Pht1家族因其功能是目前研究的最为清楚的磷转运蛋白基因。迄今，克隆到的植物磷转运蛋白基因基本上归属于Phtl和Pht2两大家族，而植物中报道不多的Pht3家族成员的线粒体磷酸盐转运蛋白基因分离依然停留在传统的RT-PCR及标记探针筛选法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于蛋白互作原理的编码线粒体磷转运蛋白基因的筛选方法，采用本发明提供的筛选方法减少时间，增强分离出的基因的可信性，为快速目标基因的分离提供简便易行的有效途径。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于蛋白互作原理的编码线粒体磷转运蛋白基因的筛选方法，包括以下步骤：

1)构建番茄cDNA文库，将得到的番茄cDNA文库与SlMPT3；1::PDHB1酵母表达载体共转化到酵母NMY51感受态细胞中，得到酵母转化体；

2)将所述步骤1)得到的酵母转化体在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His固体培养基上培养，得到菌斑，将所述菌斑在含有X-gal的SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His固体培养基上培养，挑取蓝色菌斑，对所述蓝色菌斑进行PCR检测，得到S1GPI基因互作的基因序列，经酵母双杂交系统互作和双分子荧光互补验证分析，得到S1GPI基因与S1PHT3基因互作；

3)以所述步骤2)的S1GPI基因为诱饵，筛选冰叶日中花cDNA文库，经酵母双杂交系统互作和双分子荧光互补验证分析，获得与S1GPI基因互作的冰叶日中花线粒体转运蛋白基因。