[发明专利]一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法，其特征在于：根据铜绿假单胞菌的rhlC基因序列设计PCR引物，PCR产物纯化后克隆到pMD系列T simple载体中构建pMD‑rhlC，酶切rhlC基因序列内部，构建目标基因内部序列缺失的质粒pMD‑∆rhlC，通过双酶切将∆rhlC片段插入到质粒pK18mobSacB中构建打靶质粒pK18‑∆rhlC，导入铜绿假单胞菌内，经筛选压力作用发生二次同源重组，获得敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌敲除株，敲除菌株发酵验证产生的单鼠李糖脂。本发明在鼠李糖脂的发酵生产和开发利用方面具有应用价值。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域和鼠李糖脂生产应用领域，具体为用于铜绿假单胞菌高产单鼠李糖脂的基因改造方法，解决了现有方法通过异源表达rhlAB基因合成单鼠李糖脂产量低和从常规鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐等技术问题，为单鼠李糖脂的应用与研究奠定基础。

背景技术

鼠李糖脂是主要由铜绿假单胞菌代谢合成的一种生物表面活性剂，因其表/界面活性高、安全无毒、临界胶束浓度低、可生物降解、稳定性高等优势，广泛应用于石油开采、环境污染修复、医药、食品、农业生防控制、堆肥等领域。鼠李糖脂是一系列同系物，由1到2个鼠李糖基和1到2个饱和或不饱和的不同碳链长度的脂肪酸链组成。据报道已发现的不同结构的鼠李糖脂分子有近60种。

根据鼠李糖脂分子中鼠李糖基的个数多少，将鼠李糖脂分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。鼠李糖脂所含鼠李糖基的个数必然影响其理化活性，即单鼠李糖脂和双鼠李糖脂存在活性差异，应用潜力也不同。研究表明单鼠李糖脂与双鼠李糖脂相比具有更好的亲油特性和乳化活性。这使得单鼠李糖脂在提高疏水性有机污染物的生物可利用性、乳化携带驱油、石油乳化降粘等方面具有很大的应用优势。因此，单鼠李糖脂的生产制备具有重要应用价值。

现有技术方法通过将铜绿假单胞菌中合成单鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅰ（RhlAB）的编码基因rhlAB在大肠杆菌等宿主中异源表达，虽然可以实现单鼠李糖脂的合成，但是单鼠李糖脂产量很低，约几百毫克每升。从野生型铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐、费时费力。如果敲除铜绿假单胞菌中催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅱ（RhlC）的编码基因rhlC，将会使鼠李糖脂合成途径终止在单鼠李糖脂，将能够解决上述瓶颈问题。本发明以敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌为生产菌，既实现了合成的鼠李糖脂全部为单鼠李糖脂，又实现了高产单鼠李糖脂，为单鼠李糖脂的应用与研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于铜绿假单胞菌高产单鼠李糖脂的基因改造方法，有利于解决现有方法通过异源表达rhlAB基因合成单鼠李糖脂产量低和从常规鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐等技术问题，为单鼠李糖脂的应用与研究奠定基础。采用该方法可以定向、高效地构建高产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌工程菌。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：