[发明专利]一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用

权利要求书

1.一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法，其特征在于该方法是以铜绿假单胞菌为出发菌株，以催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅱ（RhlC）的编码基因rhlC为改造目标，且按如下步骤进行：

1）根据铜绿假单胞菌的rhlC基因序列设计PCR引物；所设计的铜绿假单胞菌的rhlC基因的PCR引物为C-f：5'-CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3'，C-r: 5'-CTTGGAATTCCCGGAAGCTACGGACG-3'，上下游引物中分别引入在rhlC基因序列中没有、且在pK18mobSacB的多克隆位点（MCS）中含有的酶切位点（引物中划线部分），Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ；

2）以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增rhlC基因，克隆到pMD系列载体中，构建重组质粒pMD-rhlC；

3）根据rhlC基因序列内部特有的酶切位点，酶切rhlC基因序列内部，纯化自连，构建rhlC基因内部序列缺失的新质粒pMD-∆rhlC；

4）通过双酶切方法将∆rhlC片段插入到质粒pK18mobSacB中构建打靶质粒pK18-∆rhlC；

5）打把质粒pK18-∆rhlC导入到铜绿假单胞菌内，在筛选压力作用下，质粒pK18-∆rhlC与铜绿假单胞菌染色体基因发生二次同源重组，获得敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌敲除菌株；

6）铜绿假单胞菌敲除菌株发酵生产验证，利用HPLC-MS方法验证单鼠李糖脂产物，利用排油圈法测定单鼠李糖脂产量。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤2）：PCR扩增rhlC基因的反应体系：10×PCR Buffer2.5μL，2.5mM 的dNTP Mixture 2μL，10Μm的C-f和C-r引物各0.8μL，Extaq Polymerase0.125μL，铜绿假单胞菌基因组DNA 1μL，补充PCR水至总体系25μL；反应条件：95℃预变性3min，35个循环：94℃变性1min、56℃退火30s、72℃延伸1min30s，72℃ 10min；PCR产物经1.2%琼脂糖电泳、试剂盒切胶纯化后， rhlC基因片段与pMD系列（18/19/20）T simple载体进行AT连接，构建重组质粒pMD-rhlC。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤3）：利用限制性内切酶Sal Ⅰ试剂盒酶切质粒pMD-rhlC的rhlC基因内部序列，酶切产物经1.2%琼脂糖电泳、试剂盒切胶纯化后，自连，得到rhlC基因内部缺失400~500bp序列的新质粒pMD-∆rhlC。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤4）：利用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ试剂盒，双酶切质粒pMD-∆rhlC和铜绿假单胞菌的自杀性质粒pK18mobSacB，∆rhlC片段和pK18mobSacB质粒的双酶切产物经1.2%琼脂糖电泳、试剂盒切胶纯化后，连接，构建打靶质粒pK18-∆rhlC。

5.权利要求1所述的方法，其中步骤5）：打把质粒pK18-∆rhlC先转化到大肠杆菌S17-1感受态细胞中，构建重组大肠杆菌 S17-1 (pK18-∆rhlC)，再通过接合转移方法将质粒pK18-∆rhlC导入到铜绿假单胞菌内；在氨苄青霉素、卡那霉素和蔗糖的筛选压力作用下质粒pK18-∆rhlC与铜绿假单胞菌染色体rhlC基因的同源序列发生二次同源重组，缺失内部序列的∆rhlC基因片段替换掉染色体上的rhlC基因，筛选获得rhlC基因被破坏的铜绿假单胞菌敲除菌株。