[发明专利]一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用

说明书

本发明涉及一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，包括该赖氨酸脱羧酶基因和蛋白序列、构建的表达载体和基因工程菌株并在生物基戊二胺合成中的应用。通过构建表达载体和基因工程菌，诱导表达赖氨酸脱羧酶，全细胞催化合成戊二胺。本发明开发的新型赖氨酸脱羧酶可实现高浓度赖氨酸盐酸盐100％转化，戊二胺生产强度可达204g/L/h，其活性和催化强度均明显高于现有报道的大肠杆菌CadA及其突变体，有利于高效合成高浓度戊二胺，有工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，尤其涉及一种稳定高效合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶基因序列、蛋白序列及其构建的表达载体和重组工程菌。

背景技术

尼龙因具有优良的机械性能、耐热性、耐腐蚀性等性质而在纤维和工程塑料等多个领域被广泛应用，近年来中国尼龙产量、产能和需求量均呈增长趋势。其中尼龙66的产量和消费量巨大，但由于其核心单体己二胺的前驱体己二腈的合成技术一直被国外企业垄断，资源紧张，成本波动巨大，且主要来源于石油。

戊二胺为赖氨酸脱羧的产物，与己二胺互为同系物，由戊二胺和二元酸可以合成多种尼龙5X产品，如尼龙52、5T、54、56、510、516、518等，具有更佳的轻质减重、吸湿排汗、耐温性、耐磨性、染色性及本质阻燃等特性，具有广阔的发展前景。生物尼龙5X的合成不仅能够降低对石油资源的依存度，而且能够打破跨国企业对己二胺产品的输出和技术的垄断，在国防和航天等领域具有广阔的应用前景。

生物基尼龙5X的关键是其核心单体戊二胺的高效合成。高效稳定的赖氨酸脱羧酶是生物基戊二胺合成的核心。赖氨酸脱羧酶来源广泛，目前报道存在赖氨酸脱羧酶的微生物主要是大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、耐碱芽胞杆菌(Bacillushalodurans)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等细菌，但目前仅对少数来源的赖氨酸脱羧酶进行深入研究，如来自大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶。

CN105316270B、CN105368766A和CN104498519A中公开了利用大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶CadA构建不同的基因工程菌株，全细胞催化合成戊二胺。同时，天津科技大学使用温度调控型启动子pR-pL和信号肽pelBs对过表达载体进行改造，中国科学院微生物研究所将T7CadB整合至底盘细胞基因组中，提高了戊二胺产量。CN106148373A、EP3118312B1与US7189543对大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶CadA进行序列改造，日本味之素公司通过对CadA的定向进化，筛选到热稳定性更高的突变体，三井化学公司也在其专利中公开了活性提高10-20％的突变体。

但这些突变酶系均仅局限于对大肠杆菌诱导型赖氨酸脱羧酶CadA下改造，来源非常单一，突变菌株在赖氨酸高浓度催化转化过程中活性和催化强度低，细胞循环利用率差，增加了操作时间、生产成本，降低了戊二胺得率而制约了工业化发展。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，包括赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列、编码其的核苷酸序列、基因表达载体以及重组工程菌。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶，可催化L-赖氨酸生成戊二胺，所述赖氨酸脱羧酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)如SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列；