[发明专利]一种利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种利用RPA‑LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及其应用，包括特异性引物对以及探针，上游引物：ACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA，下游引物：Bioten‑TCATTCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATG，探针：FITC‑TAAAAAGAGACGATATTTACACAGACACAG[THF]ATTTGTAGGATATGA‑C3Spacer。本发明通过RPA‑LFS实现室温环境下现场快速对虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei,Ehp)进行检测，避免了传统巢氏需要依赖控温设备的长时间高温的检测方法，结果可用肉眼判读，更加方便，适用于Ehp的水产养殖动物疾病诊断。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种利用RPA-LFS快速检测 对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。

背景技术

虾肝肠孢虫是2009年首次在泰国斑节对虾中发现的，后逐步在 其他对虾中发现。与其他微孢子虫造成幼虾肌肉泛白等明显病症不同 的是，感染虾肝肠孢虫不会引起显著的症状，难以在早期通过肉眼观 察，但Ehp会引起幼虾生长严重迟缓，为养殖户带来巨大的经济损失。 目前已证实Ehp的传播方式主要有水平传播，及可通过嗜食同类传播 与通过粪便进行传播。但目前并没有有效的防治措施。因此对于Ehp 应采取“防重于治”的原则，做好实际风险防控。

由于Ehp感染会严重影响对虾的生长速度和成虾品质，在亚洲可 带来每年上亿元的损失，因此近年来发展了多种检测技术。但均存在 操作复杂、成本高、不适用于现场检测等问题。

即以下几点：

1、现有检测技术有显微镜观察。Ehp属于胞内寄生，需要制作 病理组织切片，并经过染色观察，目前已报道的微孢子虫染色法有抗 酸三色染色法，高锰酸钾甲基紫法，韦伯氏染色法，荧光染色法等均 可应用于Ehp检测中。但由于Ehp大小约为0.75～1um，用光学显微镜较难观察到。此外，透射电子显微镜可以提高对感染的明确诊断， 但过程费时费力且缺乏敏感性。假如每一个亲虾都用透射电子显微镜 进行观察，其成本显然十分高，因此研究中常用其他的检测方法来提 高检测的灵敏度。

2、现有检测技术有免疫学检测方法。应用免疫学检测手段可以 检测不同种类的微孢子虫，但是灵敏度不高，易出现假阳性，抗体筛 查过程缓慢，且价格昂贵等因素，限制了免疫学检测方法在Ehp检测 中的推广。

3、现有检测技术有分子生物学检测方法。包括巢式PCR、实时 荧光定量PCR法，此类检测技术需要依赖于控温设备以及专业技术人 员，适合在实验室环境下进行，推广地区受限；除此之外还有LAMP 技术，该技术可在恒温条件下进行，但引物体系复杂，易产生假阳性， 结果验证依赖于琼脂糖凝胶电泳或者样品浑浊度。琼脂糖凝胶电泳结 果呈现梯形条带，无法排除引物二聚体形成的梯形条带；浑浊度判定 依赖于主观判断，且无法判断是否是有引物二聚体扩增造成的样品浑 浊，体系稳定性不足。

为此，我们提出了一种利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特 异性引物对和试剂盒来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种 利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及 其应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测 试剂盒及其应用，包括特异性引物对以及探针：

上游引物：ACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA

下游引物：Bioten-TCATTCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATG