[发明专利]一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，进行了C端改造，切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸，本发明首次对亮氨酸脱氢酶底物进出的通道进行改造，C端切除突变体可能扩大了底物的进出通道使得底物更易与蛋白结合，获得了更加高效制备L‑2‑氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。本发明提供的亮氨酸脱氢酶突变体△_364‑374的比酶活为201U/mg，相对于野生酶提高了20％。

技术领域

本发明涉及一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸在食品、农业、生物医药等方面有着很大的应用价值，如它是用于治疗抗癫痫药物左已拉西坦、布瓦西坦的直接前体，也是用于合成治疗结核病的药物盐酸乙胺丁醇的重要手性前体。亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase,LeuDH，EC 1.4.1.9)属于氧化还原酶家族，已被广泛用于非天然氨基酸的制备，如L-2-氨基丁酸(Tao,R.,Jiang,Y.,Zhu,F.et al.A one-pot system for production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase.Biotechnol Lett 36,835–841(2014))，L-叔亮氨酸(Li J,Pan J,Zhang J,et al.Stereoselective synthesis of L-tert-leucine by a newly cloned leucine dehydrogenase from Exiguobacteriumsibiricum[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2014,105(7):11-17)等；并且已有较多文献对亮氨酸脱氢酶偶联辅酶循环及苏氨酸脱氨酶的一锅法制备进行研究优化，但是，在其制备非天然氨基酸如L-2-氨基丁酸的过程中由于亮氨酸脱氢酶催化活力低于苏氨酸脱氨酶，导致中间产物不断积累不断抑制亮氨酸脱氢酶的活性，致使亮氨酸脱氢酶不足以催化不断产生的中间产物2-酮丁酸，因此急需一种催化活力高的亮氨酸脱氢酶。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-28a质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述载体的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α。

本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后进行破碎，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。