[发明专利]一种hIL-12p40-MSCs的制备方法及其应用

说明书

本发明公开一种hIL‑12p40‑MSCs(人IL‑12p40基因修饰的MSCs)制备方法及其应用。制备方法包括(1)分离培养鉴定hMSCs；(2)克隆扩增hIL‑12p40基因；(3)构建重组hIL‑12p40慢病毒表达载体；(4)慢病毒的包装；(5)hIL‑12p40慢病毒感染MSCs；(6)MSCs表达慢病毒介导的外源性hIL‑12p40的鉴定。本发明制备的hIL‑12p40基因修饰的MSCs具有抑制细胞免疫的生物活性，且可用于制备治疗细胞免疫异常增强相关的再生障碍性贫血、移植排斥反应及自身免疫性疾病等疾病的药物，具有较好的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物治疗领域，具体涉及一种稳定表达hIL-12p40基因、可持续抑制细胞免疫的MSCs的制备方法及应用。

背景技术

白细胞介素(Interleukin-12，IL-12)是一种由激活的单核巨噬细胞、抗原提呈细胞以及B淋巴产生的细胞因子，具有重要的免疫调节作用。通常情况下，IL-12P40和P35两个亚基通过二硫键组成异源二聚体分子，即完整的IL-12P70。IL-12P70可以促进自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞(CTL)增殖，刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ等细胞毒性细胞因子，并诱导Th1细胞发育分化，增强机体的细胞免疫应答功能。此外，IL-23，IL-12异源二聚体细胞因子家族中的一员，由IL-23P19和IL-12P40两个亚基组成，通过与其受体相互作用(IL-12受体β1和IL-23受体2个亚基共同组成)作用于Th17细胞，在Th17细胞的增殖与稳定中发挥重要作用，并促进Th17细胞产生IL-17A、IL-17F及IL-22等炎症因子，进而激活T细胞等免疫细胞，形成免疫应答的级联效应，引起自身免疫性疾病。单独的P40单体或同源二聚体无生物学功能，但P40可通过竞争结合免疫细胞表面IL-12βR，竞争性拮抗IL-12P70和IL-23的生物学活性。研究显示，再生障碍性贫血、移植排斥反应以及自身免疫性疾病法生时，IL-12家族成员包括IL1-2、IL-23水平均有升高，并介导细胞免疫的异常活化，是上述疾病发病的重要机制。而抑制IL-12和IL-23的生物学功能有助于治疗以上疾病。

MSCs(mesenchymal stem cell，MSCs)是来源于中胚层的具有自我更新能力的成体干细胞。MSCs的应用较为广泛，除了作为一种重要的组织工程细胞用于治疗骨、软骨性疾病外，还是一种理想的基因运载载体细胞。MSCs作为基因运载载体具有多种优势：1.来源丰富，可以从骨髓、脐带、脐血、脂肪、羊水、胎盘等多种组织分离提取。分离培养方法简单而且扩增能力强。2.MSCs不表达或低表达HLA分子，免疫原性弱，在同种异体中也能存活较长时间。3.MSCs本身可通过分泌细胞因子(如TGF-β、IL-10)或表达表面配体的作用调节机体免疫功能。4.MSCs还具备在体内向病理损伤部位迁移的能力。

基因修饰的细胞产品制备的关键问题在于基因转移和在细胞中表达的效率。已有的基因转染悬浮细胞方法包括电转、病毒转染和脂质体瞬时转染。其中，病毒转染是最有效的方法。来源于免疫缺陷病毒的慢病毒载体(Lentivirus vector)可以以较高的转移效率将基因整合入分裂细胞或非分裂细胞基因组，使转移基因在细胞内稳定、长期表达，因而在临床基因治疗尤其是血液细胞基因修饰产品中广泛应用。从第二代慢病毒载体开始，由于去除了众多辅助独立因子，所以安全性更高，并具有更低的细胞毒性和免疫原性。

发明内容

本发明的目的在于利用IL-12P40单体或同源二聚体以及MSCs具备的抑制细胞免疫的作用，本发明提供一种hIL-12p40-MSCs的制备方法，产生的MSCs可持续稳定表达hIL-12p40，具有抑制细胞免疫的生物活性。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种hIL-12p40-MSCs的制备方法，具体步骤如下：

(1)分离培养鉴定hMSCs；

(2)克隆扩增hIL-12p40基因；