[发明专利]一种新疆杨遗传转化方法

说明书

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以叶片为受体农杆菌介导的新疆杨遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：采用无菌苗叶片作为外植体进行遗传转化，其通过利用农杆菌介导法，在共培养过程中，携带有目的基因的T‑DNA在农杆菌体内完成加工，向苗叶片的植物细胞转化，整合进植物基因组。本发明的优点是：省略了复杂的培养程序，又缩短了培养周期，其通过利用农杆菌介导法，建立新疆杨高效遗传转化体系，培育杨树新品种，并可对相关基因进行功能研究，对于进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。

技术领域

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以叶片为受体农杆菌介导的新疆杨遗传转化方法。

背景技术

新疆杨是我国重要的造林、城市绿化和工业用材树种。在我国特别是西北的生态建设和商品林建设中占有不可替代的地位。在西北地区由于气候干旱、土壤盐碱化等环境的影响，杨树的生长、代谢和生产力备受影响，其中干旱是抑制植物生长和产量的主要因素之一。它在所有的非生物限制因子中占首要地位，对林木及农作物造成的损失仅次于病虫害类等生物胁迫的损失。培育耐旱、耐盐碱的林草品种是实现困难立地造林和植被恢复的前提，可以防止荒漠化、盐碱化进一步加剧。促进生态环境特别是脆弱生态环境的建设，保障社会经济发展和人民的生产生活安全。

新疆杨虽然具有一定的抗性，但在未经改良的盐碱地、沼泽地、戈壁滩等地均生长不良。随着森林遗传工程技术的不断完善，基因转化技术在提高杨树抗逆性和品质方面的应用日益增多。

目前新疆杨转基因研究的遗传转化条件难以统一，转化效率不高，影响杨树基因功能研究，并且一般必须要经过诱导愈伤组织阶段，培养程序复杂，培养周期较长，不利于大规模复制进行遗传转化。

发明内容

本发明的目的是根据上述现有技术的不足，提供了一种新疆杨遗传转化方法，通过采用无菌苗叶片为外植体进行遗传转化，提高转化率，为林木的遗传改良提供了一个新途径。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）以新疆杨的苗叶片为外植体，对所述苗叶片进行切口，并将切口后的所述苗叶片放置于培养基上进行预培养；

（2）将经步骤（1）处理过的所述苗叶片浸入含有目的基因的农杆菌侵染菌液中并持续一定时间；

（3）将经步骤（2）处理过的苗叶片接种于培养基中进行共培养；

（4）对经步骤（3）处理的所述苗叶片进行吸取农杆菌，并转移到培养基中进行诱导选择培养直至所述苗叶片上分化出抗性芽；

（5）当步骤（4）中的所述抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行增殖抗性芽培养；

（6）当步骤（5）中的所述增殖抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行生根培养实现所述目的基因向新疆杨的遗传转化。

所述步骤（1）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养期，其组分为：MS+TDZ 0.05mg/L+IBA 0.3mg/L。

所述步骤（2）中的侵染菌液为以农杆菌作为介导，并通过下述制备步骤：

农杆菌纯化培养：用接种环从-80℃保存好的农杆菌菌液中挑取一环，然后在附加卡那霉素的LB培养基平板上划线，将培养皿倒置放在恒温培养箱中，28℃培养2-3d即可获得分离的单菌落；在超净工作台上，挑取所述单菌落，接种到无菌离心管里，附加一定量抗生素及Rif的LB液体培养基中，在恒温摇床上小摇培养；

工程菌液的制备：在超净工作台上，将培养好的菌液取200-400μL转入无菌三角瓶中，附加一定抗生素的LB液体培养基中，放置恒温摇床上，振荡培养120h至OD=0.5-0.7，从而获得所述侵染菌液。