[发明专利]一种新疆杨遗传转化方法

权利要求书

1.一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）以新疆杨的苗叶片为外植体，对所述苗叶片进行切口，并将切口后的所述苗叶片放置于培养基上进行预培养；

（2）将经步骤（1）处理过的所述苗叶片浸入含有目的基因的农杆菌侵染菌液中并持续一定时间；

（3）将经步骤（2）处理过的苗叶片接种于培养基中进行共培养；

（4）对经步骤（3）处理的所述苗叶片进行吸取农杆菌，并转移到培养基中进行诱导选择培养直至所述苗叶片上分化出抗性芽；

（5）当步骤（4）中的所述抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行增殖抗性芽培养；

（6）当步骤（5）中的所述增殖抗性芽伸长至一定长度，接种于培养基中进行生根培养实现所述目的基因向新疆杨的遗传转化。

2.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（1）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养期，其组分为：MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.3mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中的侵染菌液为以农杆菌作为介导，并通过下述制备步骤：

农杆菌纯化培养：用接种环从-80℃保存好的农杆菌菌液中挑取一环，然后在附加卡那霉素的LB培养基平板上划线，将培养皿倒置放在恒温培养箱中，28℃培养2-3d即可获得分离的单菌落；在超净工作台上，挑取所述单菌落，接种到无菌离心管里，附加一定量抗生素及Rif的LB液体培养基中，在恒温摇床上小摇培养；

工程菌液的制备：在超净工作台上，将培养好的菌液取200-400μL转入无菌三角瓶中，附加一定抗生素的LB液体培养基中，放置恒温摇床上，振荡培养120h至OD=0.5-0.7，从而获得所述侵染菌液。

4.根据权利要求3所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述恒温摇床的培养温度为28℃，转速为150rpm。

5.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将所述苗叶片浸入含有农杆菌的所述侵染菌液中振荡侵染10min，之后取出所述苗叶片放至无菌滤纸上吸取多余的侵染菌液。

6.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（3）中的所述培养基为叶片诱导不定芽培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1 mg/L+IBA 0.3mg/L。

7.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（4）中的所述培养基为不定芽诱导选择培养基，其组分为：MS+TDZ 0.1 mg/L+IBA 0.3mg/ L+Kan50mg/L+Timentin 400mg/L。

8.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）中的所述培养基为增殖培养基，其组分为：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Timentin200mg/L，pH值为5.95-5.98。

9.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（6）中的所述培养基为生根培养基，其组分为：1/2 MS+IBA 0.5mg/L+Kan 50mg/L +Timentin 200mg/L。

10.根据权利要求1所述的一种新疆杨遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（5）和所述步骤（6）中的培养温度为25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间为12h/d。