[发明专利]一种三维肿瘤模型脱细胞衍生基质支架的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法及其应用，属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域。以猪源性肾脏组织为主要材料，将其切块后，经脱细胞试剂的作用脱除细胞，之后采用冷冻干燥技术、化学交联技术制备猪肾脱细胞基质多孔支架。采用该方法制备的支架很好的保留了肾的基质、血管以及肾小球结构，且基质的生物活性得到了很好的保存，材料的利用率高且支架获取量可观；接种癌细胞后，细胞在支架的生长良好、立体分布，细胞在各层均有不同程度的渗透。

技术领域

本发明属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域，提供一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架的构建方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，已成为一种严重危害人类健康的常见病、多发病。随着肿瘤靶点及抗癌药物的不断发现，选择真实模拟体内肿瘤组织的模型是筛选有效抗癌药物的重要手段。

实体肿瘤在体内以三维模式生长，其发生发展过程是肿瘤细胞与其微环境及机体之间不断相互作用的结果。肿瘤微环境是影响细胞分泌、粘附、增殖分化、侵袭和转移等生物学行为的重要因素。体外3D肿瘤模型能够在体外构建与体内相近的细胞生长系统，较好地提供肿瘤细胞生长的三维空间结构及模拟细胞生长的微环境，体现肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用。因此，体外构建的三维肿瘤模型受到了越来越多研究者的青睐，用于肿瘤细胞生物学行为及抗癌药物筛选的研究。

目前，组织工程技术已逐步用于构建体外三维肿瘤模型，研究结果表明肿瘤细胞接种于支架材料后形成的三维结构比二维平面更好模拟体内肿瘤组织，特别是模拟细胞间及细胞-胞外基质间相互作用。其中使用的支架材料多为天然材料和高分子合成材料，高分子合成材料在降解性能及可塑性方面基本能满足支架材料的要求，但是其生物相容性远不如天然材料，而天然材料弊端主要在于机械性能差，多需要与其他材料复合。器官/组织来源的脱细胞基质生物材料因能直接保留天然胞外基质微环境被逐渐应用在生物医学领域。其主要是利用脱细胞技术去除组织/器官中的细胞成分和遗传物质，尽可能的保留原ECM成分、生物活性及机械性能，去细胞后拥有良好的结构脉络网，为细胞提供了理想的生长环境。其中，猪源性肾组织在生理结构及基因组学等方面与人体肾相似。猪肾脱细胞基质不仅包含多种蛋白如胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等，猪肾有复杂且多孔的三维结构为细胞生长及增殖提供了一个更加接近人体环境的三维空间。目前关于制备猪肾脱细胞基质支架多用于构建组织工程肾，为治疗慢性肾功能衰竭的一项有效手段—肾移植提供供体，且其去细胞化的方法大都是采用全器官灌注法进行脱细胞，借助肾组织的脉络循环清除所有的细胞成分。这种方法通常需要沿肾动脉插入留置针以建立灌注通道，在一定的灌注压强下，将脱细胞试剂经蠕动泵贯穿全肾，来达到全器官肾去细胞化的效果，而且需要大量的脱细胞试剂来完成该操作。全器官肾脱细胞支架正是解决器官移植问题，脱细胞针对整个肾脏组织，必须建立一个无菌的灌注系统，接下来的接种细胞再生肾，同样需要在无菌的环境下进行，操作缺乏灵活性。

本发明以猪源性肾脏组织为研究对象，将猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，剩下的猪肾切成体积为10～16cm³的块状，用十二烷基磺酸钠(离子型去细胞试剂)去除细胞成分，待细胞除去小块变为透明状基质时放入冷冻干燥机进行干燥，得到多孔的三维肿瘤模型支架。为了改善支架的稳定性和机械性能，在此基础上，通过化学交联法对猪肾脱细胞支架进行交联。该发明获得的猪肾源脱细胞衍生基质支架用于体外构建3D肿瘤模型，表现出良好的生物相容性，支架上细胞呈现的生长模式与人体内实体瘤更加接近，适用于抗癌药物的筛选研究。

发明内容

本发明的内容旨在建立一种以猪肾脱细胞基质支架为平台的三维肿瘤模型，构建方法以及在治疗疾病方面的应用。这种方法制备出来的支架基质保留的十分完整且生物活性也得到很好的保存，操作简单且支架获取量可观。

为了达到以上所说的效果，本发明的技术方案为：

一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，所述构建方法以猪源性肾脏组织为主要材料，待脱除细胞后，采用冷冻干燥方法得到多孔支架，包括以下步骤：