[发明专利]一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，它包括如下步骤：(1)破碎菌体；(2)澄清浓缩；(3)盐析；(4)脱盐；(5)吸附解析；(6)加载固化；(7)贮存。本发明的固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，降低了提取所需设备成本及生产成本。降低了杂质酯酶含量，缩短了反应时间，提高了反应批次。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种固定化头孢菌素C酰化酶的方法。

背景技术

头孢菌素C酰化酶(CCA)是一步酶法生产7-氨基头孢氨酸(7-ACA) 的关键酶，能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化，脱去7-位的D-α氨基己二酰侧链，生成7-ACA。

头孢菌素C酰化酶(CCA)作用分子式如下所示：

头孢菌素C酰化酶(CCA)生产过程中，用大孔树脂吸附与离子交换时两者对滤液的要求较高，滤液中含有大量的无机离子影响树脂吸附与交换；滤液中还大量存在可溶性蛋白，使树脂污染，吸附效果变差，树脂使用寿命变短；现有提取CPC酰化酶方法生产的固定化CPC酰化酶D值较高，酶活衰减快，反应批次少；已有文献报道的提取CPC酰化酶的方法满足CPC残留≤200时反应时间较长，D值平均残留≥0.4，难以满足7-ACA生产的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)破碎菌体：取头孢菌素C酰化酶发酵液离心，收集发酵菌体，加磷酸盐缓冲液，混匀，均质，均质液加入絮凝剂，搅拌，离心，收集轻相得粗液酶；

(2)澄清浓缩：向步骤(1)粗液酶加入氯化钙溶液，离心，收集上清液浓缩，得浓缩液；

(3)盐析：向步骤(2)浓缩液加入硫酸铵，溶解，混匀，降温至15-20℃，搅拌，离心收集重相蛋白，加入磷酸盐缓冲液溶解，离心，收集轻相得液酶；

(4)脱盐：将步骤(3)液酶降温至8-15℃，脱盐，得脱盐液；

(5)吸附解析：将步骤(4)脱盐液上样于树脂柱，用含0.03-0.05mol/l Nacl的磷酸盐缓冲液解析，收集解析液；

(6)加载固定：向步骤(5)解析液加入大孔吸附树脂，搅拌固化，得固定化头孢菌素C酰化酶；

(7)贮存：漂洗步骤(6)固定化酶，干燥，加入生物酶杀菌剂，搅拌，即得。

进一步的，步骤(1)所述加磷酸盐缓冲液至原体积的2.5倍；所述均质压强为80-120Mpa；所述均质液用12％氢氧化钾调pH值至6.8-7.2；所述均质液与絮凝剂的体积比1000：23；所述搅拌时间为1h。

进一步的，所述絮凝剂为聚季铵盐-37。

进一步的，步骤(2)所述粗液酶与氯化钙溶液的体积比为1000:18；所述氯化钙溶液浓度为25％；所述浓缩是用能截留分子量10000的超滤膜浓缩。

进一步的，步骤(3)所述加硫酸铵至其浓度为1.5-2.2mol/L；所述搅拌速度为20-30rpm，时间2h；所述重相蛋白与磷酸缓冲盐的质量体积比为1： 7.5。

进一步的，步骤(4)所述脱盐是用能去小分子阴离子的脱盐膜组脱盐。

进一步的，步骤(5)所述磷酸盐缓冲液的用量为1.5BV。

进一步的，步骤(6)所述大孔吸附树脂的加入量为每1g大孔吸附树脂加载1500u酶活；所述固化温度为25-28℃，时间24h。