[发明专利]一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法

权利要求书

1.一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)破碎菌体：取头孢菌素C酰化酶发酵液离心，收集发酵菌体，加磷酸盐缓冲液，混匀，均质，均质液加入絮凝剂，搅拌，离心，收集轻相得粗液酶；

(2)澄清浓缩：向步骤(1)粗液酶加入氯化钙溶液，离心，收集上清液浓缩，得浓缩液；

(3)盐析：向步骤(2)浓缩液加入硫酸铵，溶解，混匀，降温至15-20℃，搅拌，离心收集重相蛋白，加入磷酸盐缓冲液溶解，离心，收集轻相得液酶；

(4)脱盐：将步骤(3)液酶降温至8-15℃，脱盐，得脱盐液；

(5)吸附解析：将步骤(4)脱盐液上样于树脂柱，用含0.03-0.05mol/l Nacl的磷酸盐缓冲液解析，收集解析液；

(6)加载固定：向步骤(5)解析液加入大孔吸附树脂，搅拌固化，得固定化头孢菌素C酰化酶；

(7)贮存：漂洗步骤(6)固定化酶，干燥，加入生物酶杀菌剂，搅拌，即得。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)所述加磷酸盐缓冲液至原体积的2.5倍；所述均质压强为80-120Mpa；所述均质液用12％氢氧化钾调pH值至6.8-7.2；所述均质液与絮凝剂的体积比1000：23；所述搅拌时间为1h。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述絮凝剂为聚季铵盐-37。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)所述粗液酶与氯化钙溶液的体积比为1000:18；所述氯化钙溶液浓度为25％；所述浓缩是用能截留分子量10000的超滤膜浓缩。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)所述加硫酸铵至其浓度为1.5-2.2mol/L；所述搅拌速度为20-30rpm，时间2h；所述重相蛋白与磷酸缓冲盐的质量体积比为1：7.5。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(4)所述脱盐是用能去小分子阴离子的脱盐膜组脱盐。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(5)所述磷酸盐缓冲液的用量为1.5BV。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(6)所述大孔吸附树脂的加入量为每1g大孔吸附树脂加载1500u酶活；所述固化温度为25-28℃，时间24h。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(7)所述漂洗是用10倍体积纯化水漂洗；所述干燥是离心甩干；所述生物酶杀菌剂与干燥后固定化酶的体积质量比为5：1；所述生物酶杀菌剂是将生物酶杀菌剂以12g:1000ml比例溶解在磷酸盐缓冲液中制备而成。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液是0.1M pH7.50磷酸钾缓冲液。