[发明专利]一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法

说明书

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法。本发明所述方法以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将骨髓间充质干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，可以更好的模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间三维结构，能更好的模拟体内生理环境的不同生物力学作用下细胞生长的微环境，促进骨髓间充质干细胞生长、增殖、粘附、分化等生物学功能，更适用于椎间盘组织修复和纤维环组织再生等医学组织工程领域以及生物力学领域的研究。

技术领域

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，具有强大的自我更新和分化潜能，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。BMSCs具有全面的分泌功能，可分泌生长因子、趋化因子、黏附分子、细胞外基质分子等，并通过这些因子的相互作用，调节骨髓和血液微环境，引导干细胞向受损组织迁移、并增殖、分化，促进受损组织的修复再生。基于这些生物学特性，BMSCs已成为组织工程中修复受损组织的理想种子细胞。

研究表示，在体外建立模拟体内的三维生长环境，对于体外培养骨髓间充质干细胞具有更好的促进生长及分化作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对骨髓间充质干细胞行为及生理功能具有重要影响。传统的经单层平面培养的细胞，由于无基质支持，骨髓间充质干细胞仅能贴壁生长，导致细胞的形态特征、基因表达、生长分化能力等均与天然的生理环境有所差异，无论是在细胞形态、结果和功能等多方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，不利于骨髓间充质干细胞在医学组织修复和再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。

三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。

目前，骨髓间充质干细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法，是通过将生长状态良好的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化后，与Matrigel基质胶混悬后快速接种于培养板内，待形成凝胶后加入低糖DMEM完全培养基进行常规培养，整个过程存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的骨髓间充质干细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长和分化功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，骨髓间充质干细胞生长的研究。

此外，多个研究中使用的三维基质多为合成聚合物或共聚物，但这些材料主要是由直径大约10-50μm的微纤维组成，纤维尺寸与大多数的细胞尺寸十分相近，在这种支撑材料中生长的细胞事实上仍处于二维环境中，不利于细胞的预期生长。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，以解决现有技术中传统三维细胞培养技术效果不理想的问题。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；

所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：