[发明专利]一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制Collagel凝胶培养基质，备用；

所述Collagel凝胶培养基质包括如下成分：

试剂A：5×MEM；

试剂B：FBS(胎牛血清)；

试剂C：1M Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；

试剂D：0.1M NaOH与5×MEM的混合液；

Collagel凝胶：2-10mg/ml COL1(Ⅰ型胶原蛋白)与0.01M HCl的混合液；

(2)取分离的骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，并计数；

(3)将所述细胞与所述Collagel凝胶培养基质混合均匀，得到细胞-Colagel悬液；

(4)取细胞培养板，并以表面包被材料对所述细胞培养板表面进行包被，并培养过夜，备用；

(5)取步骤(3)得到的细胞-Colagel悬液加入至包被后的细胞培养板中，置于CO₂培养箱中进行细胞培养，即得。

2.根据权利要求1所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述Collagel凝胶培养基质的配置步骤具体包括：

(a)取所述试剂A、试剂B和试剂C进行混合，备用；

(b)另取试剂D和Collagel，并调节混合液pH7.0-7.2，备用；

(c)分别将上述步骤(a)和(b)制备的混合液混匀，即得。

3.根据权利要求1或2所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和Collagel的体积比为(6-10)：(2-8)：(0.5-2)：(1-3)：(30-40)。

4.根据权利要求1-3任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括调节细胞浓度，使平均Collagel培养基基质中细胞浓度为2.0×10⁵细胞/mL的步骤。

5.根据权利要求4所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括将所述细胞-Colagel悬液进行固液分离并收集细胞以所述Collagel培养基质进行重悬的步骤。

6.根据权利要求1-5任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述表面包被材料包括弹性蛋白、层粘连蛋白以及ProNectin(RGD)。

7.根据权利要求6所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述表面包被材料包括2-10μg/mL弹性蛋白、5-30μg/mL层粘连蛋白以及5-30μg/mL ProNectin(RGD)。

8.根据权利要求1-7任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％CO₂恒温培养。

9.根据权利要求8所述基于Collagel凝胶支架法三维培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，还包括在培养的第3、5和7天，更换所述细胞培养板内培养基的步骤，以及观察培养细胞形态的步骤。

10.由权利要求1-9任一项所述基于Collagel凝胶支架法三维培养的骨髓间充质干细胞。