[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法

说明书

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法。所述草铵膦脱氢酶突变体由来源于荧光假单胞菌的草铵膦脱氢酶第164位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸所得，第205位精氨酸突变为赖氨酸，第332位苏氨酸突变为丙氨酸获得的所得，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述基因工程菌为将所述草铵膦脱氢酶突变体的基因导入宿主细胞。宿主细胞中还可以将葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶的编码基因也导入，进行同步定向进化，使双基因过表达。本发明一锅法多酶同步定向进化方法可以筛选到活性大大提高的基因工程菌。本发明L‑PPT制备方法与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，且立体选择性高。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，特别是涉及一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法。

背景技术

草铵膦(phosphinothricin，也叫glufosinate，简称PPT)的化学名称为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的制备方法主要有三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如Cao等人(CaoC-H,Cheng F,Xue Y-P,Zheng Y-G(2020)Efficient synthesis of L-phosphinothricinusing a novel aminoacylase mined from Stenotrophomonas maltophilia.Enzyme andMicrobial Technology 135doi:10.1016/j.enzmictec.2019.109493)采用一种来源于Stenotrophomonas maltophilia的新型的氨基酰化酶手性拆分N-乙酰-PPT，得到L-草铵膦。用全细胞进行催化，在4小时内转化率49％，获得了光学纯的L-PPT(99.9％e.e.)。