[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法

权利要求书

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，由来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的草铵膦脱氢酶第164位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第205位精氨酸突变为赖氨酸，第332位苏氨酸突变为丙氨酸所得，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的基因。

3.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包含如权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，目的基因还包括葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶突变体的编码基因，

使用双基因表达载体，所述草铵膦脱氢酶突变体的基因克隆到其中一个多克隆位点区域，葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶突变体的编码基因克隆到第二个多克隆位点区域，

所述甲酸脱氢酶突变体的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，甲酸脱氢酶突变体是将第224的组氨酸突变为谷氨酰胺。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因序列GenBank登录号为KM817194.1，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因起始密码子与质粒上对应核糖体结合位点之间的连接碱基长度为8～10bp。

6.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体、如权利要求2所述基因或如权利要求3～5任一所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

7.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，葡萄糖或甲酸铵为辅助底物，在无机氨基供体和辅酶循环系统存在的条件下，利用催化剂催化底物反应获得L-草铵膦；

所述辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统或甲酸脱氢酶循环系统；所述催化剂为如权利要求4～5任一所述的基因工程菌、该基因工程菌的粗酶液或固定化的所述基因工程菌，

当所述基因工程菌中含有所述葡萄糖脱氢酶的编码基因时，辅助底物为葡萄糖，辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统；当所述基因工程菌中含有所述甲酸脱氢酶的编码基因时，辅助底物为甲酸铵，辅酶循环系统为甲酸脱氢酶循环系统。