[发明专利]使用CRISPR-Cas9系统对间充质干细胞进行CKIP-1基因敲除的方法

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑Cas9系统对间充质干细胞进行CKIP‑1基因编辑，特别是涉及一种构建CKIP‑1基因敲除的人骨髓间充质干细胞细胞系的建立，用于骨组织生理功能以及创伤修复再生后续研究。其中构建并获得了一个特异的gRNA，能够显著提高间充质干细胞内CRISPR‑Cas9针对CKIP‑1的基因编辑效率。本发明构建的CKIP‑1基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞分裂、增殖传递到下一代，形成稳定的CKIP‑1基因敲除细胞系。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的涉及一种利用CRISPR-Cas9技术敲除间充质干细胞CKIP-1基因的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)，又称间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells)，源于发育早期的中胚层和外胚层，几乎存在于所有生物组织类型中，如骨髓、脂肪组织和牙髓等。MSC是具有自我更新能力和分化为多种细胞类型的多能干细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、类固醇生成细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、运动神经元和内皮细胞等。同时能分泌产生大量细胞因子和生长因子等生物活性因子，以旁分泌方式作用于微环境，发挥促血管生成、抗纤维化、抗凋亡和免疫调节功能。此外，MSC备显著归巢能力，可迁移至损伤部位进行免疫调节、位点特异性分化和支持造血等。更为重要的是，不论是自体还是同种异源的MSC，一般都不会引起宿主的免疫反应。这些特性使MSC成为细胞治疗的优秀候选细胞，广泛用于实验、临床研究和基因工程中，用于骨骼、心脏、软骨、中枢神经、皮肤等的再生，在组织修复领域具有广阔的应用前景。

基因编辑技术主要研究基因相关功能与表型的关系，已成为现代分子生物学的研究热点，未来期望被用于人类遗传性疾病、癌症、自身免疫疾病等重大疾病的治疗。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中，在RNA指导下可以降解病毒或噬菌体等外源DNA。CRISPR-Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅱ型系统中Cas9核酸内切酶Rnase将前体crRNA剪切为成熟crRNA，成熟crRNA含有与目标DNA互补配对的非重复间隔序列，通过识别PAM序列引导Cas9蛋白对目标DNA序列进行切割。现代常用的基因编辑技术CRISPR-Cas9就是由此改造成的，把人工设计的引导RNA(gRNA)与Cas9构成重组质粒，gRNA引导Cas9核酸酶对靶标基因组进行结合与切割，使DNA双链发生断裂，断裂的双链DNA被细胞内自然存在的DNA修复系统修复，从而完成对靶标DNA的突变修饰。CRISPR-Cas9技术能够实现基因定点敲除、敲入和突变等基因编辑功能，目前已经被广泛应用于各类细胞和模式动物的基因组编辑，在疾病治疗方面取得了较大的突破。