[发明专利]一种siRNA递送系统复合物及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种siRNA递送系统复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将胆固醇与Boc保护的组氨酸加入到二氯甲烷中，继续向二氯甲烷中加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温反应14-16h，依次将白色析出物过滤掉、减压下除去溶剂、纯化，得到Boc保护的组氨酸胆固醇基酯中间体；

S2、将S1制得的Boc保护的组氨酸胆固醇基酯中间体溶于二氯甲烷，继续加入三氟乙酸，搅拌1-1.5h，然后用氨水溶液中和，减压蒸发溶剂，将残余物在乙酸乙酯中稀释，依次洗涤、干燥，再次减压蒸发溶剂得到白色粉末状的组氨酸胆固醇基酯中间体；

S3、将S2制得的组氨酸胆固醇基酯溶于四氢呋喃，制得A溶液，将羧甲基壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于质量分数为1％的乙酸溶液中，室温活化，加入A溶液，室温下反应70-72h，减压蒸发四氢呋喃，后加入无水乙醇蓄积沉淀，保留沉淀，沉淀依次经四氢呋喃、丙酮和乙醚洗涤，得到白色粉末状的组氨酸胆固醇基酯修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物；

S4、将碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于浓度为0.1mmol靶向标记物溶液中，活化羧基1-1.5h，得到活化的靶向标记物溶液，将S3制得的组氨酸胆固醇基酯修饰的羧甲基壳聚糖溶于质量分数为0.8-1％的盐酸溶液中，搅拌下滴入活化后的靶向标记物溶液，4℃下反应22-24h，然后冷冻干燥，得到组氨酸胆固醇基酯与靶向标记物共同修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物；所述靶向标记物为EGFR单克隆抗体、HER2单克隆抗体、PSMA单克隆抗体或者含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的RGD短肽；

S5、将组氨酸胆固醇基酯与靶向标记物共同修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物溶于浓度为20Mm，pH7.4的HEPES缓冲液中，超声处理，然后纯化，得到纳米球状载体；

S6、将siRNA溶于浓度为0.56mg/ml纳米球状载体溶液，溶液中siRNA与纳米球状载体的比例为1pmol：0.01-0.2ug并在暗处储存30min以上，得到siRNA递送系统复合物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中胆固醇、Boc保护的组氨酸、二氯甲烷、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的比例为200-220mg：125-135mg：10-12mL：1.8-2mg；

S2中，Boc保护的组氨酸胆固醇基酯中间体、二氯甲烷、三氟乙酸和氨水溶液的质量体积比为200-220mg：6-8mL：0.8-1mL：1.8-2mL；

S3中，组氨酸胆固醇基酯与四氢呋喃的质量体积比为500-520mg：100mL，羧甲基壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、A溶液和无水乙醇的质量体积比为480-500mg：240-260mg：150-160mg：48-50mL：198-200mL：

S4中，碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、靶向标记物溶液、组氨酸胆固醇基酯和盐酸溶液的质量体积比为38-40mg：22-23mg：1.8-2mL：40-42mg：10-12mL；

S5中，组氨酸胆固醇基酯与靶向标记物共同修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物和HEPES缓冲液的质量体积比为10-12mg：5-6mL。

3.权利要求2所述的制备方法制备的组氨酸胆固醇基酯修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物。

4.权利要求2所述制备方法制备的组氨酸胆固醇基酯与靶向标记物共同修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物。

5.权利要求2所述的制备方法制备的具有主动靶向与pH响应性质子化的多功能纳米球状载体。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述siRNA沉默与肿瘤发生增殖、及转移相关的基因。

7.权利要求6所述的制备方法制备的siRNA递送系统复合物。

8.如权利要求7所述的siRNA递送系统复合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途，其特征在于，所述靶向标记物为EGFR单克隆抗体，所述siRNA的碱基序列为5’-UGG AUU UGUACC AUU CUU CUG-3'。