[发明专利]一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法

说明书

本发明公开了一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。本发明使用甲醇/甲酸(9:1,v/v)为溶剂，加入内标后，对番茄果实中花青素进行液液萃取，4℃提取12h后，离心取上清，过膜后，对花青素的质谱信息和光谱信息进行同时采集，对番茄果实中花青素进行定量，并进行结构解析。该检测方法前处理过程简易，检测结果精确，不需要繁琐的前处理提纯步骤。该发明可用于对番茄果实中花青素进行定性定量分析。

技术领域

本发明涉及一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。

背景技术

由于氧自由基吸收能力，花青素是一类对人体健康有益的物质，同时也具有药用价值。在植物中，花青素可以提高植物抵抗逆境的能力。因此，花青素的识别，纯化及其结构解析成为研究的热点。花青素的结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子，主要包括矢车菊素(cyanindin)、天竺葵素(pelargonidin)、飞燕草素(delphinidin)、芍药素(peonidin)、矮牵牛素(petunidin)和锦葵素(malvidin)几大类。花青素的结构解析很重要，但因其结构相似度高，解析困难。

花青素是通过类黄酮代谢通路合成的，如图1所示。苯丙氨酸在一系列酶的作用下，合成花青素，包括PAL，苯丙氨酸氨裂解酶；CA4H，肉桂酸4-羟化酶；4CL，4-香豆酸辅酶A连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查耳酮异构酶；F3H，黄烷酮-3-羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；F3’H，类黄酮3'-羟化酶；F3’5’H，类黄酮-3',5'-羟化酶；OMT1，黄酮3'-O-甲基转移酶1；DFR，二氢黄酮醇还原酶等。最后经过糖基化修饰和酰基化修饰形成花青素后，运输到液泡中存储。

番茄中的花青素是在光诱导下进行生物合成的。目前，番茄中报道的花青素有9种。其中，矮牵牛素-3-(顺式-对香豆酸酰氧基)-芸香糖苷-5-葡萄糖苷是番茄花青素的主要成分。番茄是一种市场很受欢迎的果实，但是其果实花青素含量并没有优化。因此，有必要通过研究花青素的合成机理优化番茄中花青素的含量。尽管，研究者通过尝试已经提高了番茄果实中的花青素含量，但是其精确调控还很困难。其中，重要的一个原因就是番茄中合成的花青素详细结构并未被完全解析。花青素的结构修饰包括羟基化、甲基化、糖基化和酰基化。羟基化和甲基化是花青素结构被羟基和甲基直接修饰。糖基化是在2-苯基苯并吡喃阳离子的羟基上由单糖、二糖或三糖进行修饰。酰基化修饰是在糖基化修饰后，在糖苷的羟基上进一步加香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等进行修饰。这些结构修饰会增加花青素的稳定性。

前处理及检测过程对花青素的快速定量及其结构的精确解析有重要影响。之前的研究，大多采用冻干法处理样品。由于冻干时间较长，花青素在此过程会有部分损失。花青素提取后的纯化多采用柱层析法或固相萃取法。柱层析除了需要特殊的柱子，实验技术要求高。固相萃取法需要特殊的设备及纯化柱，价格昂贵，并且要经过活化、平衡、上样、清洗和洗脱等步骤。由于处理流程长，在纯化过程中，含量较少的花青素可能会丢失，如锦葵素类花青素。为了保证前处理完后，有足够的花青素用于检测，需要采集大量样品，如1kg番茄果皮。同时，也要使用大量的溶剂已达到完全萃取的目的。另外，萃取溶剂中加酸会增加花青素的稳定性，但是无机酸可能会导致样品降解，如盐酸可能导致糖苷键的水解。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。

本发明提供了一种对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法，该方法包括：

1)将原料冷冻磨碎后，使用提取剂a提取，得到提取液a；离心，收集上清液，氮气吹干，再加入提取剂b重新溶解，过滤，收集滤液，得到提取液b；

所述原料为分开的番茄果皮和番茄果肉；

2)将所述提取液b用液相色谱和质谱联用进行花青素种类的解析；

3)对所述提取液b所得不同种类花青素的含量进行定量分析，完成所述番茄果实中花青素的种类解析和含量测定。