[发明专利]一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用

说明书

本发明涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及其应用，该体系利用带对称羧基和对称氨基的极性稀土配合物荧光分子作为长寿命荧光供体；高摩尔消光系数、高荧光量子产率的有机荧光小分子作为长寿命荧光受体，构成时间分辨荧光共振能量转移探针配对。长寿命荧光供体是笼状稀土铕配合物，带有负电荷衍生基团；受体分子是一种具备高摩尔消光系数和高荧光量子产率的有机荧光染料，其摩尔消光系数大于等于250,000cm^‑1M^‑1，荧光量子产率≥28％。受体分子为Alexa Fluor647或者Dylight650。该体系用于核酸检测、免疫检测，实现高灵敏均相检测。

技术领域

本发明涉及一种时间分辨荧光共振能量转移体系及应用，属于免疫分析领域。

背景技术

半个多世纪以来，主流的免疫检测技术历经放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等阶段，放射免疫分析由于放射性问题目前用量已经很少，酶联免疫分析由于检测时间长正逐渐被替代，化学发光免疫分析是目前的主流免疫分析技术。在急诊等即时检测领域，化学发光由于技术复杂和成本高而难以广泛运用，这些需求催生了即时检测类免疫检测技术，如胶体金免疫分析、荧光层析免疫分析、胶体比浊免疫分析等，但是即时检测免疫分析技术存在精度差的共同问题，仅能作为辅助初筛检测手段，最终还需要化学发光免疫分析来确认。化学发光免疫分析技术诞生于上世纪七十年代，采用的主流技术是磁微粒化学发光，其核心假设在于“通过磁分离一定可以实现特异性免疫复合物和生物基质的分离”，但在临床实际应用中，由于临床标本的多样性，不可避免出现磁分离失效的案例，例如纤维蛋白黏连引起非特异性吸附导致的“跳值”现象，以及异嗜性抗体导致的假阳性等。对仪器自身而言，一半的故障是磁清洗故障引起的。因此免清洗的免疫分析技术近二三十年一直是研究热点，西门子、贝克曼等公司都有相关技术储备，国内企业北京科美生物公司基于西门子专利光激化学发光技术推出一系列高通量免疫分析系统，首次实现了免清洗检测在临床的应用，这一技术存在的问题在于发射光在不同样本中透过率存在较大差异，当检测溶血、高血脂样本时准确度较差。

时间分辨荧光共振能量转移免疫分析技术(time-resolved FRET,TR-FRET)，最早由德国勃拉姆斯(brahms)公司基于法国诺贝尔化学奖得主Jean-Marie Lehn发现的超分子稀土穴醚探针开发而成，克服了均相检测中由于溶血、高血脂、黄疸等样本异常对准确度的影响。与其他免疫检测技术相比具有众多优势，该技术无需固相载体与固相探针，精密度和准确度好，操作简单，易于自动化和微型化等等。

时间分辨荧光共振能量转移方法的核心是两个荧光分子，分别叫供体和受体，其中供体可以吸收激发光，自身可以发出荧光，也可以通过荧光共振能量转移方式传递给受体，由受体发出荧光。只有两种荧光分子很好配合，发生免疫反应时，才能产生明显的信号。

具体而言，其是利用具有穴状结构的稀土元素的螯合标记物作为荧光供体，以及与荧光供体具有良好光谱重叠的短寿命荧光分子作为荧光受体，在稀土元素穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间发生荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命接近供体的发射荧光的寿命。因为供体荧光衰减周期较长，所以供体会诱导受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。