[发明专利]一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒

权利要求书

1.一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：包括碱性磷酸酶标记F(ab')₂HBsAg羊多抗，磁微粒-HBsAg抗体。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：碱性磷酸酶标记F(ab')₂HBsAg羊多抗的工作浓度为0.01～0.5μg/mL；磁微粒-HBsAg抗体的工作浓度为0.1-2mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：碱性磷酸酶标记F(ab')₂HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，

1)待标记原料F(ab')₂HBsAg羊多抗装入透析袋中，用0.02-0.05M的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2)将标记原料F(ab')₂HBsAg羊多抗与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合，之后用0.02-0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h，期间换液2-3次；

3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

4.根据权利要求3所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，

1)配制2-15mg/mL ALP溶液；

2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；

4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。

5.根据权利要求3所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：所述F(ab')₂HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，

1)取抗体HBsAg羊多抗溶液，逐滴加入等体积饱和硫酸铵并不断搅拌，室温静置30min后12000rpm离心5min，弃上清；

2)按抗体量加入0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解抗体，并使抗体终浓度为5-20mg/ml，最后透析至0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液；

3)用0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解胃蛋白酶，终浓度为50-200mg/ml；

4)按抗体：胃蛋白酶质量比(5-20)：1的比例，向抗体溶液中加入胃蛋白酶，并充分混匀；

5)于37℃水浴反应30min，期间不断混匀样品，加入适量1-3M Tris，pH7-9，调节反应体系pH至中性终止反应；

6)将酶切后抗体溶液透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中；

7)在还原和非还原条件下，SDS-PAGE检测抗体酶切程度，分析抗体是否酶切完全。

6.根据权利要求5所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：所述F(ab')₂HBsAg羊多抗的制备还包括纯化过程，所述纯化过程包括以下步骤，

a)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱；

b)将酶切完全的抗体产物透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中，过滤后上样至用pH5-710-30mM哌嗪缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱，弃穿透液；

c)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液继续洗涤柱子，至UV值降至20mAU；

d)用含1-5M NaCl pH5-7，10-30mM哌嗪缓冲液洗脱，收集洗脱峰；

e)将洗脱液透析至PBS缓冲液中，即为F(ab’)₂抗体片段。