[发明专利]利用固定化酶制备他汀中间体的方法

说明书

本发明提供了一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法，包括如下步骤：使用固定化载体Seplite LX‑1000NH和LX‑G20将羰基还原酶固定化，得到固定化酶；使用固定化酶催化6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯，催化(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6‑氯‑(3R,5S)‑二羟基己酸叔丁酯。本发明的方法稳定性好，能够生成高光学纯度的产物，有效降低生产成本，适合于工业化应用。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法。

背景技术

他汀类药物是临床上最常用的血脂调节药，是国内外心脑血管疾病防治的重大基础药物。下述式A7所示的阿伐他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：125971-93-9)、式A8所示的(4R,6R)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-乙酸叔丁酯(CAS号为125971-94-0，阿伐他汀钙侧链ATS-8)、式D3所示的瑞舒伐他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：154026-93-4)都是他汀类药物的重要手性化合物中间体。

发明人在专利文献CN110387359A中报道了三种羰基还原酶SEQ ID NO:2-4能够催化式A6进行不对称还原反应得到化合物A7；并且催化式D2进行不对称还原反应得到化合物D3。该方法能够解决化学法生产所造成的严重污染问题。

但是，该酶催化法生产中使用的是游离的羰基还原酶，一次反应完毕后，昂贵的酶就被废弃，无法重复使用，导致原料成本居高不下。另外，作为一种蛋白质，在搅拌反应中，游离酶的机械稳定性和耐热稳定性都比较脆弱，也会影响其在工业化生产他汀类药物中间体中的应用。

与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产工艺简化、生产效率提高等优点。同时，由于固定化酶可多次使用、稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了产物提纯工艺，使得产品质量稳定。

发明内容

为了克服游离羰基还原酶的上述问题，发明人对于酶的固定化技术进行了研究和大量实验探索。意外地发现，专利文献CN110387359A中报道的羰基还原酶在采用吸附法用个别载体固定化后，能够保持较高的酶活力和显著提高的稳定性，而且产物的手性纯度不降反升，这对于追求光学活性产品手性纯度的制药领域而言极为有利。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法，包括如下步骤：

A.使用固定化载体Seplite LX-1000NH和LX-G20将羰基还原酶固定化，得到固定化酶；B.使用步骤A中得到的固定化酶催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，或者催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。

优选地，上述固定化载体是Seplite LX-1000NH。

上述羰基还原酶的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:1：