[发明专利]一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测方法及其应用，所述检测体系包括不对称PCR扩增体系和CRISPR‑Cas检测体系；所述不对称PCR扩增体系包括正向及反向特异性引物对。本发明通过调节正/反向引物的比例控制PCR体系中单链DNA的积累，利用产生的反向单链DNA激活CRISPR‑Cas体系的顺式切割活性，进行目标双链DNA的检测，消除了PAM序列对传统的CRISPR‑Cas检测体系的限制作用，扩大了CRISPR‑Cas检测体系的适用范围。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，属于核酸检测技术领域，涉及一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测方法及其应用。

背景技术

Jennifer Doudna于2018年初发现，如图1所示，当Cas12a蛋白、gRNA和目标双链DNA(target dsDNA)形成三元复合结构时，Cas12a蛋白不仅会反式切割target dsDNA，而且会无差别顺式切割附近的短链探针DNA(Probe ssDNA)，因此设计两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团的短链探针DNA，当其被切断时即可产生荧光，而一定时间内，荧光强度与目标DNA的浓度成正比，利用CRISPR体系的这一特性，可以对目标DNA进行快速实时的荧光检测(Chen J S,Ma E,Harrington L B,et al.CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity[J].Science,2018,360(6387):436-439.)。2018年3月12日，中国科学院赵国屏团队深入系统地研究了CRISPR-Cas12a体系对靶标单链DNA和非靶标单链DNA的切割特性，再次证明了CRISPR-Cas12a体系在核酸检测领域的独特优势(Li S Y,Cheng Q X,Liu J K,et al.CRISPR-Cas12a has both cis-andtrans-cleavage activities on single-stranded DNA[J].Cell research,2018,28(4):491-493.)。紧接着，张锋课题组基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)，利用CRISPR-Cas12a体系实现了痕量目标DNA在纸基材质上的快速检测，灵敏度可达aM/L数量级(Gootenberg J S,Abudayyeh O O,Kellner M J,et al.Multiplexed and portablenucleic acid detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6[J].Science,2018,360(6387):439-444.)。Janice S.Chen认为，CRISPR-Cas12a可以作为一种强有力的工具，用于各种来源的DNA检测，DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR TransReporter)技术有可能适用于任何基于DNA分析的POCT检测，包括癌症和传染病。

CN 110541022A公开了基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒，所述试剂盒通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，利用CRISPR-Cas12a特异靶向结核分枝杆菌复合群靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性，可从痰中灵敏、特异地检出结核杆菌分枝复合群，具有无侵入性、可频繁多次检测、检测速度快等优势。

CRISPR靶向特异性由两部分决定，一部分是RNA嵌合体(crRNA)和目标DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas蛋白和一个短DNA序列(通常在目标DNA的3'末端)的相互作用，这个短DNA序列被称为protospacer adjacent motif(PAM)，因此，CRISPR-Cas12a体系强烈依赖目标DNA中的PAM序列，即当目标DNA中不含有PAM序列(TTTN)时，CRISPR-Cas12a体系中的Cas12a蛋白便无法通过gRNA与target DNA结合，顺式切割活性无法被激活，检测体系就会失效，这极大地限制了该体系的适用性。