[发明专利]一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测方法及其应用在审
| 申请号： | 202010583843.4 | 申请日： | 2020-06-23 |
| 公开（公告）号： | CN111662968A | 公开（公告）日： | 2020-09-15 |
| 发明（设计）人： | 蒋兴宇;陈勇 | 申请（专利权）人： | 南方科技大学 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 潘登 |
| 地址： | 518055 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr pam 序列 dna 检测 方法 及其 应用 | ||
1.一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括不对称PCR扩增体系和CRISPR-Cas检测体系；
所述不对称PCR扩增体系包括正向及反向特异性引物对；
所述特异性引物对中的正向引物的摩尔量小于反向引物。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述不对称PCR扩增体系还包括DNA聚合酶、dNTPs和模板。
3.根据权利要求1或2所述的检测体系，其特征在于，所述CRISPR-Cas检测体系包括Cas蛋白和crRNA；
优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a和/或Cas12b；
优选地，所述Cas蛋白包括AsCas12a、LbCas12a、FnCas12a、AaCas12b、BhCas12b或AkCas12b中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述CRISPR-Cas检测体系还包括探针DNA；
优选地，所述探针DNA的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
4.一种基于CRISPR的无PAM序列DNA的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)采用目标DNA的特异性引物对进行不对称PCR；
(2)利用CRISPR-Cas检测体系检测扩增产物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引物对中的正向引物的摩尔量小于反向引物；
优选地，所述不对称PCR的条件为93～95℃变性30～40s，50～60℃退火10～30s，70～72℃延伸20～30s，循环30～40次。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas检测体系中含有探针DNA；
优选地，所述探针DNA的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
7.一种基于CRISPR的CYP1A1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物；
优选地，所述正向引物和反向引物的摩尔比为1:(2～50)；
优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和dNTPs。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白和crRNA；
优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a和/或Cas12b；
优选地，所述Cas蛋白包括AsCas12a、LbCas12a、FnCas12a、AaCas12b、BhCas12b或AkCas12b中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述crRNA如SEQ ID NO:3所示。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针；
优选地，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；
优选地，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
10.一种权利要求1-3任一项所述的检测体系在检测无PAM序列DNA的中的应用。
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