[发明专利]一种提高烟叶品质的方法

权利要求书

1.一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，包括：

筛选的具有类胡萝卜素降解能力的菌种；

将所筛选的菌种制备为生物制剂；以及

生物制剂应用于烟叶醇化获得具有类胡萝卜素降解产物的烟叶；所述菌种为从烤烟中分离出的高地芽孢杆菌，所述高地芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC:61029；

所述菌种或生物制剂有助于提高烟叶品质的代谢产物包括二氢猕猴桃内酯、β-环柠檬醛、4-氧化二氢异氟尔酮、（E）-大马士酮、β-紫罗兰酮、3-羟基-a-紫罗兰酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烷-2-酮、香叶基丙酮、异戊酸香叶酯；

所述菌种能分泌较高活性的中性、酸性蛋白酶，能实现烟叶中高分子含氮物质的降解。

2.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述生物制剂应用于烟叶醇化具体步骤如下：

将生物制剂与无菌水混合，制备成1×10^8~10 cfu/mL的菌悬液，按10%~20 %的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，在30~40 ℃，湿度70~80 %条件下培养12~48 h，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80~90 ℃温度下烘干水分至13~14 %，终止菌株继续代谢。

3.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述生物制剂制备步骤如下：

将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37 ℃振荡培养24 h，发酵液在10000 g，4℃条件下离心10 min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85 %的生理盐水洗涤菌泥2~3遍，再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用。

4.如权利要求1所述的一种提高烟叶品质的方法，其特征在于，所述菌种筛选具体步骤如下：

烟叶表面微生物收集：

从醇化箱中不同的位置，采用五点取样法选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10 g浸入装有200毫升0.1 M，0.85 %生理盐水的250 mL锥形瓶中，在220 rpm和30℃下振荡3小时，用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液；

微生物分离：

取含烟叶表面微生物的所述滤出液200 μL，均匀涂布于含有烟叶提取液的LB固态培养基上，37℃恒温培养2天，待长出的菌落数量种类不变；采用微生物挑选系统 QPix™400将平板上的菌落无菌转接于含有初筛培养基的96孔板上，在30℃恒温避光培养中3天；并以未接入菌落的培养物作为对照，利用酶标仪在540 nm波长下，考察各菌落对培养基中类胡萝卜素物质叶黄素降解能力；选择OD540值发生变化明显的菌株，利用微生物挑选系统 QPix™400转接到96深孔板中，30℃、400 rpm恒温振荡避光培养3天后，用孔板离心机在3500 g,4℃条件下对培养液离心，分离菌体及发酵上清液；对上清液中叶黄素含量变化进行测定比较，复筛对叶黄素降解能力较大的菌体，洗涤菌体沉淀加无菌水制成菌悬液，通过平板分离纯化菌株，培养获得菌悬液后与50 %甘油按1:1比例混合，保藏于-80℃的超低温冰箱中备用；

筛选培养基：

蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、酵母提取物5 g/L，叶黄素40 mg/L、pH 7.2；其中叶黄素预先溶于含有少量吐温-80的70 %的乙醇溶液中，用0.45μm微滤膜无菌过滤后备用；培养基中其他成分经121 ℃、20 min灭菌后冷却，在接种前，在培养基中迅速添加叶黄素溶液。

5.一种高地芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1-4任一项所述的方法所得的高地芽孢杆菌用于烟叶发酵中，所述高地芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC:61029。