[发明专利]一种在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸合成途径的方法

说明书

本发明公开了一种在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸合成途径的方法，属于生物工程技术领域。本发明以酿酒酵母BY4741 opi1缺失株为出发菌株，本发明通过亲合体脚手架拉近Inm1和MIOX4‑Udh空间距离，提高途径效率。本发明将肌醇单磷酸酶基因INM1的启动子替换为P_TDH3并在其N端加上Ztag标签，然后将肌醇加氧酶MIOX4和糖醛酸脱氢酶Udh通过linker连接，并在融合蛋白的N端添加Z_IgA标签，与Anti‑Ztag‑Anti‑Z_IgA一起整合在opi缺失株基因组的Delta位点，通过对葡萄糖二酸产量的筛选获得葡萄糖二酸高产菌株，使构建的工程菌的葡萄糖二酸的产量提高了75％。

技术领域

本发明涉及一种在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸合成途径的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡萄糖二酸(Glucaric acid，GA)是一种自然界存在的二元酸，它在化工材料、医疗保健和食品添加剂等方面都有广泛的应用，如合成洗涤剂、缓蚀剂、己二酸、酯和聚酰胺衍生物等1或用于降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等。因此，葡萄糖二酸被认为是“最具价值的生物炼制产品(top value-added chemicals from biomass)之一”。葡萄糖化学氧化法合成葡萄糖二酸存在非选择性、高成本、得率低、需高温以及副产物多不利于分离等问题。目前报道的全生物法合成葡萄糖二酸主要在大肠杆菌和一些真菌中进行，大肠杆菌中合成葡萄糖二酸的产量被许多因素限制。酿酒酵母比大肠杆菌具有更高的工业应用价值和优点，并且已经被广泛用于产有机酸的研究。因此，利用酿酒酵母生物合成葡萄糖二酸具有很好的应用前景。

近年来，国内外研究团队利用合成生物学思路实现了微生物以肌醇为底物发酵生产葡萄糖二酸的多种方法。在大肠杆菌中通过表达酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1、小鼠肌醇氧化酶MIOX(myo-inositol oxygenase)和丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶Udh构建的葡萄糖二酸合成途径，产量为1g/L；随后，利用脚手架蛋白提高MIOX比活力后，葡萄糖二酸的产量提高到2.5g/L。分别利用蛋白融合和定向进化技术提高MIOX的稳定性和酶活后，重组大肠杆菌能够利用10.8g/L肌醇合成4.85g/L葡萄糖二酸。敲除大肠杆菌磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf、糖原合成途径中的葡萄糖磷酸变位酶基因pgm和糖酵解途径中的磷酸果糖激酶基因pfk可以促进细胞积累葡萄糖-6-磷酸提高葡萄糖二酸的产量。在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达cscB,cscA,cscK,ino1,miox,udh和suhB等基因后，大肠杆菌可以利用蔗糖合成葡萄糖二酸，通过进一步代谢改造，葡萄糖二酸的产量达1.42g/L，产率为0.142g/g蔗糖。

酿酒酵母具有耐酸能力强、耐低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点，其本身也可作为单细胞蛋白用于饲料、食品等，因而酿酒酵母已经广泛用于产有机酸的研究，如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸和青蒿酸等。通过酿酒酵母代谢工程合成葡萄糖二酸最大的优势是它能够利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇(图1)，Prather课题组将外源MIOX和UDH基因引入酿酒酵母进行异源表达，实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母产葡萄糖二酸，但是其产量在上罐培养条件下只有1.6g/L。前期研究发现，葡萄糖二酸合成途径中关键酶的表达量和活性都不高，这些因素都限制了葡萄糖二酸的合成。因此，如何强化葡萄糖二酸合成途径效率是进一步提高工程菌产葡萄糖二酸能力的关键问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提高一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，是以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，在基因组的Delta位点上整合有肌醇单磷酸酶基因INM1，通过linker融合连接的肌醇加氧酶MIOX4和糖醛酸脱氢酶Udh的编码基因和编码亲合体脚手架蛋白的基因；所述肌醇加氧酶MIOX4来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)所述糖醛酸脱氢酶Udh来源于丁香假单胞菌。