[发明专利]一种在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸合成途径的方法在审

申请号：	202010581329.7	申请日：	2020-06-23
公开（公告）号：	CN111635868A	公开（公告）日：	2020-09-08
发明（设计）人：	邓禹;赵运英;徐驰;李杰;郗洋铭;皮燕;张居旺;许锦可	申请（专利权）人：	江南大学
主分类号：	C12N1/19	分类号：	C12N1/19;C12N15/81;C12P7/58;C12R1/865
代理公司：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211	代理人：	仇钰莹
地址：	214000 江苏***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	一种酿酒酵母细胞构建葡萄糖合成途径方法
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【权利要求书】：

1.一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，在基因组的Delta位点上整合有肌醇单磷酸酶基因INM1、通过linker融合连接的肌醇加氧酶MIOX4和糖醛酸脱氢酶Udh的编码基因，并含有编码亲合体脚手架蛋白的基因；所述肌醇加氧酶MIOX4来源于拟南芥；所述糖醛酸脱氢酶Udh来源于丁香假单胞菌。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述肌醇单磷酸酶基因INM1的N端具有Ztag标签；所述基因INM1的启动子为P_TDH3启动子。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，融合肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶的基因片段的N端含有IgA标签。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述肌醇加氧酶MIOX4和Udh通过linker：EAAAAKEAAAAKEAAAAK融合表达。

5.一种构建权利要求1～4任一所述酿酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建肌醇加氧酶和糖醛酸脱氢酶的整合框MIOX4-udh；构建整合框Anti-ZTaq-anti-ZigA；

(2)将步骤(1)的整合框整合至opi缺失株基因组的Delta位点上；

(3)筛选葡萄糖二酸产量相对于出发菌株提高的转化子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Anti-Ztag-Anti-Z_IgA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)筛选葡萄糖二酸产量比对照提高1倍以上的转化子。

8.一种产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的酿酒酵母工程菌接种至含葡萄糖和肌醇的培养基中，于28～30℃发酵至少120h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵还在发酵第24～48h内补加至少一次葡萄糖。

10.权利要求1～4任一所述的酿酒酵母基因工程菌或权利要求8～9任一所述方法在制备葡萄糖二酸或其衍生产品方面的应用。