[发明专利]一种掺杂二茂铁甲酸的ZIF-8猝灭RuSi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器

权利要求书

1.一种掺杂二茂铁甲酸的ZIF-8猝灭RuSi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

（1）使用洗衣粉，乙醇，丙酮，超纯水分别对分割好的ITO玻璃进行超声处理，使ITO玻璃表面清洁无污；

（2）将6 µL 5~10 mg/mL RuSiNPs@g-C₃N₄ 的壳聚糖溶液滴涂到ITO玻璃表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂5 µL 500 µg/mL一抗溶液于玻璃表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（4）滴涂3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）将6 µL不同浓度的降钙素原滴涂在玻璃表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将5 µL 1～5 mg/mL 二抗-二茂铁甲酸/ZIF-8液滴涂在玻璃表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光生物传感器；

所述的RuSiNPs@g- C₃N₄壳聚糖溶液制备步骤如下：

将5 g三聚氰胺充分研磨，然后放入带盖的陶瓷坩埚中，在马弗炉中550 ºC下加热4小时，将得到的产物研磨成粉末，然后溶解于100 mL 12 moL/L的HNO₃中超声3小时，在125 ºC下回流24小时，然后将回流的产物用超纯水洗涤至中性，将产物在60 ºC真空干燥箱中干燥，得到g-C₃N₄.

将5~10 mg g-C₃N₄加入到7.5 mL环己烷中，超声至g-C₃N₄完全分散，然后将1.77 mL曲拉通X-100，1.8 mL正己醇，200 μL N-丁基二乙醇胺和340 μL Ru(bpy)₃²⁺混合，然后加入100μL 正硅酸乙酯，60 μL 氨水，形成乳化反应，该反应在磁性搅拌下持续24 h后，加入丙酮破坏乳化反应使反应物结束，将所得溶液离心，收集沉淀用超纯水和乙醇洗涤，60 ºC烘干，实现了RuSiNPs@g-C₃N₄的制备；

称取5 mg RuSiNPs@g-C₃N₄溶解于1 mL、质量分数为0.5 %的壳聚糖溶液中，制得RuSiNPs@g-C₃N₄壳聚糖溶液；

所述质量分数为0.5 %的壳聚糖溶液，是将0.5 g壳聚糖加入到100 mL体积分数为1 %的乙酸中，搅拌2 h制得。

2.如权利要求1所述的一种掺杂二茂铁甲酸的ZIF-8猝灭RuSi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述的二抗-二茂铁甲酸/ZIF-8制备步骤如下：

（1）二茂铁甲酸/ZIF-8的制备

将1 mL 2-甲基咪唑与10~20 mg 二茂铁甲酸混合，然后加入到1 mL 20 mM乙酸锌溶液中搅拌4 h，最后，将得到的二茂铁甲酸/ZIF-8离心、洗涤，真空干燥；

（2）二抗-二茂铁甲酸/ZIF-8的制备

通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化ZIF-8表面的羧基与二抗表面的氨基反应，将抗体固定在二茂铁甲酸/ZIF-8的表面，将5 mg 二茂铁甲酸/ZIF-8分散在1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声30 min，然后，加入500 μL 100 mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和500 μL 400 mM N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌1h，再将1mL 500 μg/mL二抗溶液加入到上述溶液中，4 ºC搅拌6 h，最后，加入100 μL 1%BSA封闭非特异性位点，离心得到二抗-二茂铁甲酸/ZIF-8，将其分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液（）中，保存在4 ºC冰箱中待用。

3.如权利要求1所述的一种掺杂二茂铁甲酸的ZIF-8猝灭RuSi纳米微粒检测降钙素原的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述电化学发光传感器用于降钙素原的检测，检测步骤如下：

（1）将参比电极-Ag/AgCl电极、对电极-铂电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光

电倍增管的高压设置为850 V，扫描电压设置为0～1.2 V，扫速设置为0.10 V/s；

（2）使用磷酸盐缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学发光信号强度；

所述磷酸盐缓冲溶液，其pH=5.5～9.0，是用1/15 mol/L Na₂HPO₄和1/15 mol/L KH₂PO₄

配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与降钙素原浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。