[发明专利]一种支原体的通用PCR检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种支原体通用PCR检测方法及其检测试剂盒。本发明选取16S rRNA序列V6高变区和V9高变区序列作为支原体特异性通用引物设计区域，在保证特异性的前提下，多处引入兼并碱基，设计并筛选获得MF20.1/MF20.2/MR21(序列1/序列2/序列3)作为支原体的通用PCR检测引物，能最大范围地检测各种支原体(鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、牛支原体、猪鼻支原体、猪肺炎支原体、衣阿华支原体等)。特异性检测结果表明，各种动物细胞(Vero细胞、SP‑20细胞、Marc 145细胞等)、细菌(大肠杆菌、沙门氏菌等)均无特异性扩增条带。本发明PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可用于细胞、病毒培养物、组织液、血清、兽用生物制品及人类疫苗及生物制品的支原体检测与检验。

本发明涉及一种支原体的通用PCR检测方法及其检测试剂盒，属于微生物领域的支原体鉴别检测。

支原体是当前所发现的能够独立繁殖的最小生物，其结构简单，缺少细胞壁，没有固定的形态，在固体培养基上一般呈“煎蛋状”菌落。基因组小，仅1000kb左右，是基因组最小的生殖支原体，仅600kb左右，G+C％低于30％。按照国际细菌系统分类标准，支原体为原核生物界、软壁菌门、软膜体纲、支原体目，支原体目下有三个科，为支原体科、无胆甾原体科及螺原体科，而与细胞支原体污染有关的主要为支原体科和无胆甾原体科成员。支原体的转录系统与革兰氏阳性细菌的相似，在进化树上也与革兰氏阳性细菌有着较近的亲缘关系，因此有人认为支原体是由革兰氏阳性细菌退化而来。

支原体缺乏细胞壁，对青霉素类抗生素不敏感，但有具有革兰氏阳性细菌的部分特点，因而对链霉素对敏感性也十分有限。支原体在人工培养过程中，培养液除了pH发生变化外，基本上能保持澄清透明，只在培养后期活菌滴度达到峰值时才会出现轻度混浊。这些特点也为支原体污染细胞和病毒培养物而不容被发现提供了良好支持。在细胞培养和病毒的细胞繁殖中，最为常见的污染就是支原体污染，细胞培养液中常用加入双抗(青霉素和链霉素)抑制细菌污染，但对支原体的作用十分有限。

目前支原体的检测方法主要包括常规分离培养法、酶联免疫吸附试验、核酸杂交技术和PCR技术。培养法仍是当前世界公认对检测支原体的金标准，能较为准确地检测支原体活菌，但该方法存在耗时长达30天，而且工作量大、受培养基质量和培养条件影响大等弊端。酶联免疫吸附试验采用抗体夹心法检测支原体污染，具有良好的特异性和灵敏性，但检测试剂盒生产成本高，试剂昂贵；DNA荧光染色法则通过检测支原体基因组DNA中A-T富集区，特异性较差，通常作为辅助方法使用；核酸杂交技术由于特异性和敏感性有限，对操作要求较高，具体实际应用较为少见。PCR检测方法以其快速、准确、高敏感性和特异性的特点，成为当前应用最多的一种支原体快速检测方法，部分企业和单位也有开发出了一些可用的检测试剂。

16S rRNA作为细菌特有的分子标记，已有广泛的应用。细菌的16S rRNA全长约1500bp左右，其中含有12个明显的高变区(V区)，即V1～V12高变区，这些高变区具有较强的种属特异性，并被广泛应用于微生物菌落的扩增子分析，成为物种分类的依据。本专利使用了16S rRNA的种属特异性特点，通过从Silva数据库下载SILVA_123_SSURef的16S rRNA数据库，从中提取支原体的16S rRNA序列共计452条，再通过核苷酸比对，从选取V6高变区和V9高变区为引物设计目标区段，共设计9对引物，再通过试验验证其特异性和敏感性，获得当前专利要求的特异性好、敏感性高的MF20.1/MR21引物，再通过后续试验优化增加一条上游引物MF20.2，在保障特异性和敏感性的前提下，对支原体对扩增范围更广。

本发明对检测引物设计中使用了多对兼并序列，在保证特异性的条件下，能最大范围地检测各种支原体，包括鸭支原体、无黄无胆甾原体、牛支原体、猪鼻支原体、猪肺炎支原体、衣阿华支原体等。特异性检测结果表明，各种动物细胞包括Vero细胞、SP-20细胞、Marc 145细胞等均无扩增条带，细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌等均无扩增条带。

发明内容