[发明专利]一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及培养方法

权利要求书

1.一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒，其特征在于，包括，由Anti-CD3抗体及注射用肝素钠配置而成的包被液，由抗人CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林配置而成的诱导液，由IL-2和IL-21配置而成的扩增液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液 1 ml、诱导液1 ml、扩增液1ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度范围为100 µg/ml~1000 µg/ml；肝素钠有效浓度范围为500 IU/cm²~2000 IU/cm²。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液中，Anti-CD3抗体有效浓度为500 µg/ml；肝素钠有效浓度为1000 IU/cm²。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度范围分别为10 ng/ml~100 ng/ml、100 IU/ml~500 IU/ml、100IU/ml~500 IU/ml和20 ng/ml~50 ng/ml。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导液中，Anti-CD28抗体、IL-2、IL-1α和沙培林的有效浓度分别为50 ng/ml、250 IU/ml、500 IU/ml和25 ng/ml。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增液中，IL-2和IL-21的有效浓度范围分别为1000 IU/ml ~2000 IU/ml和200 IU/ml~1000 IU/ml。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增液中，IL-2和IL-21的有效浓度分别为1500 IU/ml和500 IU/ml。

9.一种利用权利要求1-8中任何一个试剂盒培养高效杀伤细胞的培养方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）培养包被瓶：吸取1 ml包被液与4 ml缓冲液混合于一个悬浮培养瓶中，包被液孵育悬浮培养瓶2小时，使用前去除包被液;

（2）制备PBMC：采集肝素钠抗凝人外周血20 -30 ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56 ℃ 30 min灭活处理离心备用；用缓冲液按1:1的比例稀释分离血浆后的细胞，注到淋巴细胞分离液上缓升缓降离心，小心吸取单个核细胞；用缓冲液重悬离心洗涤三次，在最后一次离心之前进行计数；

（3）制备ACTM培养基及NK细胞和CIK细胞的活化:吸取1 ml诱导液加入200 ml无血清培养液内配制成ACTM培养基；用20 ml含10%自体灭活血浆ACTM培养基重悬单个核细胞，接种到包被瓶，细胞密度范围为2-3×10⁶个/ml，静置于37 ℃ 5% CO₂培养箱培养，第三天、第五天补加ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵ 个/ml;

（4）制备EXPM培养基: 吸取1 ml扩增液按加入2.3 L无血清培养液内配制成EXPM;

（5）NK细胞及CIK细胞的扩增：第7天转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM培养基，细胞密度维持5-7×10⁵ 个/ml，静置于37 ℃ 5% CO₂培养箱培养；

（6）细胞检测：培养至第十四天，收获细胞并洗涤计数、检测，其中通过流式细胞仪检测NK 和CIK细胞所占比例，同时进行细胞活性检测、杀瘤活性、内毒素、真菌细菌和支原体检测。