[发明专利]一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法

说明书

本发明公开一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法，所述保存液包括乙烯乙二醇1.0‑6.0mol/L、丙二醇1.0‑7.0mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1‑2.5mol/L、Caspase抑制剂Z‑VAD‑FMK 10‑50μmol/L、2‑10mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X。本发明公开的保存液可以有效提高软骨，肌腱，半月板组织冷冻保存后的组织内活细胞数、细胞活率，更重要的是在冷冻复苏时和在储存期间能防止冰晶重新生长，防止去玻璃化。这种新型的无冰晶冷冻保护液使软骨，肌腱，半月板可以保存更长的时间，在小于‑130℃环境下永久保存。

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法。

背景技术

软骨，肌腱，半月板作为一种结构相似的组织，由细胞、基质和纤维组成，它的主要生理功能是提供一个摩擦轴承表面，保护关节连接性，降低关节在活动中的负荷，减少关节接触压力，在冷冻保存时也经常可以采用相同的保存方法。可用于临床软骨，肌腱，半月板损伤和病变时的修复，置换术。在临床实践中，选择软骨，肌腱，半月板组织移植治疗疾病通常涉及到供体软骨，肌腱，半月板组织的离体保存。目前软骨，肌腱，半月板组织的离体保存方法有两种，一种是软骨，肌腱，半月板冷藏保存，一种是软骨，肌腱，半月板冷冻保存。软骨，肌腱，半月板组织冷藏保存时间一般不超过8周，延长软骨，肌腱，半月板保存时间需要使用软骨，肌腱，半月板冷冻保存技术，但传统常规的软骨，肌腱，半月板组织冻存技术不可避免的会对软骨，肌腱，半月板组织产生极大的破坏，有文献显示使用常规的冻存技术冻存软骨，肌腱，半月板时，软骨，肌腱，半月板内活细胞数低于50％，并且空间结构遭到严重破坏。而且常规冷冻保存的软骨，肌腱，半月板通常会因为软骨，肌腱，半月板细胞不足、软骨，肌腱，半月板空间结构的破坏而导致软骨，肌腱，半月板移植失败。

细胞冻存时细胞内的水分会在降温过程中形成大量冰晶，冰晶的形成会导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤(细胞膜被冰晶刺破)、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等。加入冻存保护剂(如甘油或DMSO等)，可使细胞质中的水冰点降低，在缓慢降温的过程中，细胞质内的水分可以通过细胞膜透出细胞，减少细胞内冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存时出现的损伤种类及损伤程度。无冰晶冷冻通过增加温度传导的速度和冷冻保护剂的浓度，使细胞内外液由液态转化为类似玻璃状的非晶体化固体状态，形成透明的玻璃状固体，保留细胞内液体正常的分子和离子分布，减少冰晶形成，提高细胞存活。因软骨，肌腱，半月板这三类组织结构，细胞，间质成分都类似，冻存保护剂渗透，组织热传导，冰晶的形成在这些组织都相似，对组织的损伤都相同，一种无冰晶冷冻保存的方法通常可适用于所有这些组织。

众所周知，冷冻保护剂的浓度越高对细胞和组织造成的毒性就越大。所以现存的玻璃化冷冻保护液都采用最小浓度的冷冻保护剂，只要在冷冻降温是可形成玻璃化即可。但这种玻璃化状态是极不稳定的，在冷冻降温时形成的极小的，肉眼看不见的，无害的冰晶，一旦遇到环境的变化就会重新生长，冰晶变大变多，甚至出现去玻璃化。这种环境的变化随时都可发生，可以是在样本离开进入储存容器时，可以是在运输样本时，可以是在储存期间开启关闭储存容器时，温度的变化。特别是在复温时，细胞在通过冷冻保护液冰点时重新再结晶。因现存的这种无冰晶冷冻玻璃化状态十分不稳定，随时可出现重新结冰(Recrystallization)，去玻璃化(Devitrification)，极大地影响着储存的样本活率和功能。

CN104938478A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，采用的冷冻保护液，每1000ml包含：99.9％二甲基亚砜150～250ml、乙酰胺110～200g、1,2-丙二醇70～120ml、聚乙二醇10～80g、海藻糖20～100g，余为去离子水。使软骨细胞存活率在冷冻保存第8周时仍保持在一个较高水平(由传统组的60％提高到68％)。