[发明专利]一种美登木素衍生物及其合成方法和应用

说明书

本发明涉及一种美登木素衍生物及其合成方法和应用。本发明构建了包含丙氨酰化酶基因astC的整合型表达载体pSBT11‑astC，并实现了丙氨酰化酶基因在珍贵橙色束丝放线菌突变株中的异源表达。从表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌突变株的粗提物分离纯化一个丙氨酰化后修饰的美登木素衍生物。体外抗肿瘤活性试验表明，该化合物对人宫颈癌细胞(HeLa)、人结肠癌细胞(HCT116)和人乳腺癌细胞(MDA‑MB‑231)的IC₅₀值分别为3.1、9.4和10.4nM，因此可用于制备抗肿瘤药物，可与不同的抗体和连接子组成制抗体偶联物。

技术领域

本发明提供一种具有肿瘤抑制活性的美登木素衍生物，具体涉及美登木素衍生物及其制备方法和应用，属于天然药物化学与医药应用技术领域。

背景技术

美登木素属于安莎类大环内酰胺，根据其来源可分为植物美登木素和细菌美登木素两大类，都有极强的抗菌和抗肿瘤活性。研究发现美登木素衍生物可以结合微管蛋白β亚基，阻止微管束聚集形成，破坏有丝分裂过程，从而抑制肿瘤细胞生长。由于存在神经毒性，美登木素衍生物不能直接用于临床，但可以作为“弹头”与特异免疫蛋白偶联发挥抗癌作用。2013年，首个针对实体瘤的抗体偶联物药物ado-trastuzumab entansine(商品名Kadcyla)被FDA批准用于治疗HER2阳性乳腺癌，美登木素抗体偶联物药物的研发再次引起了广泛关注。

与植物美登木素相比，细菌美登木素的产量高、制备流程简单，可以为美登木素抗体偶联物药物的生产提供价格低廉的原料。然而，细菌美登木素(即安丝菌素)原始结构中并没有合适的、与连接子进行偶联的位点，需要通过还原反应脱去C-3位酯基，然后再选择性丙氨酰化。该方法不但成本高、产率低，还有不易分离除去的副产物，严重阻碍美登木素抗体偶联物药物的研究、生产和临床应用。

本发明的目标是通过生物合成高效制备具有偶联位点的丙氨酰化美登木素衍生物，将可能极大加快美登木素抗体偶联物药物的研发进程，因此对于发现广谱高效且具有自主知识产权的新型抗肿瘤药物具有重要意义。

发明内容

对美登木素衍生物抗肿瘤构效关系的研究发现，C-3位酯基侧链对其抗肿瘤活性起关键作用(Chem Pharm Bull 2004,52,1-26)，用于制备美登木素抗体偶联物的是C-3位含有二硫键或巯基的丙氨酰美登醇衍生物。虽然放线菌中美登木素衍生物的产量较高，但无法产生C-3位为丙氨酰基的化合物。

针对现有技术的不足，本发明提供一种美登木素衍生物，该化合物由放线菌产生、在结构中具有C-3位丙氨酰基。本发明还提供美登木素衍生物的合成方法和应用。

一、美登木素衍生物

一种美登木素衍生物，其化学结构如下所示：

二、美登木素衍生物的合成方法

本发明所述美登木素衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用YMG培养基对表达有丙氨酰化酶的珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum ssp.autantium ATCC 31565)的突变株HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-astC进行15L固体发酵，28-30℃培养7-10天；

(2)将培养物切成小块，室温下用体积比80:20的乙酸乙酯/甲醇浸泡提取三次，合并提取液，减压及38-40℃的温度下浓缩至干，得粗提物；

(3)用水溶解粗提物，使用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得EA提取物；

(4)EA提取物溶于甲醇，再经石油醚多次萃取，甲醇相减压及38-40℃的温度下浓缩至干得甲醇提取物；