[发明专利]3羟基根皮苷的制备及其工艺优化

说明书

本发明涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其反应条件温和，生产能耗小，环境污染少，可操作性强，步骤包括：取一定体积的粗酶液，加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min。确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM，转化时间6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL^‑1。此条件下由公式计算的理论值为93%，得到3‑羟基根皮苷的摩尔转化率为92.5%±0.525%；取转化液，用等体积甲醇稀释，0.22μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3‑羟基根皮苷含量，并根据其标准曲线回归方程计算含量；将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30‑90%乙甲醇依次洗脱，收集含3‑羟基根皮苷的组分，浓缩干燥得到黄色无定形粉末3‑羟基根皮苷。

技术领域

本发明涉及一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。

背景技术

湖北海棠原产地适应性极强，在我国广为分布，但湖北西部连片分布，是湖北海棠原产地。是良好的可利用资源。具有药用、食用、观赏多种价值。卫生部2014年第20号公告批准湖北海棠（茶海棠）叶为新食品原料。《湖北省中药材质量标准》2009年版收载了药材质量标准。

湖北海棠叶作茶饮用已有千年历史。含有根皮苷、3-羟基根皮苷、齐墩果酸、熊果酸等化合物。具有保肝、雌激素样作用等多种作用。其作用是多种成分共同作用的结果。湖北海棠叶早期以根皮苷为主要成分。为了控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用。同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。我们发明了一种微生物转化根皮苷生产3羟基根皮苷的方法。

发明内容

本发明的目的在于：控制海棠茶内在成分比例，优化药理作用，同时制备不同成分，进一步扩大湖北海棠的应用。具体地提供了一种制备及其工艺优化方法：它包括如下操作步骤：

（1）粗酶的制备：

①菌种的扩大培养：取斜面菌种接种至平板培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7d，备用。

②菌种液体发酵：a.接种用菌悬液制备：将平板上菌种接种于装有玻璃珠的200mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，制得种子液;b.液体发酵：以5%的接种量吸取种子液至200 mL 发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下培养。

③粗酶获得与酶活测定：a.粗酶：收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，收集沉淀;沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶;b.多酚氧化酶活性测定：粗酶用适宜缓冲液溶解，取1mL粗酶液+2mL0.1mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液+3mL反应液（pH6.5缓冲液：0.1%脯氨酸：0.1M邻苯二酚=10:2:3），37℃，反应10min，以每分钟OD₄₂₀值增加0.001为一个酶活力单位，以沸水浴灭活1mL粗酶液+2mL 0.1mol/L的pH6.5磷酸缓冲液+3mL反应液同步反应做空白。

（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应。

（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物。

（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分，浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷。