[发明专利]3羟基根皮苷的制备及其工艺优化

权利要求书

1.本发明涉及3羟基根皮苷的制备及其工艺优化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：（1）粗酶的制备：取斜面菌种于25℃恒温培养箱中培养7d，接种于装有玻璃珠的200 mL发酵培养基中，于30 ℃、120 r/min条件下，培养24 h，用50%硫酸铵4℃下盐析12h，在4℃于12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，沉淀加入少量去离子水，溶解，脱盐，冷冻干燥得到粗酶；（2）根皮苷的生物转化方法：取上述一定体积的粗酶液，按照实验设计加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于实验要求温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应；（3）取转化液，用等体积甲醇稀释， 0.22 μm的微孔滤膜过滤；采用HPLC分析滤液中的根皮苷和3-羟基根皮苷含量，并根据他们的标准曲线回归方程计算含量；实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物；（4）分离纯化：将上述所得反应液用大孔树脂吸附，水洗去杂，然后用30-90%乙甲醇依次洗脱，收集含3-羟基根皮苷的组分；浓缩干燥得到黄色无定形粉末3-羟基根皮苷；（5）3-羟基根皮苷鉴定：化合物黄色无定形粉末，其ESI-MS质谱显示其准分子离子峰475[M+Na]⁺，结合NMR数据，得出其分子式为C₂₁H₂₄O₁₁，推测化合物可能为查耳酮类型的黄酮类化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：3-羟基根皮苷生成率按如下公式计算：3-羟基根皮苷生成率=×100%，式中：C₁为转化液中3-羟基根皮苷的摩尔浓度，g/L；C为反应液原始根皮苷摩尔浓度。

3.根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于：根据PB实验结果，选取影响3羟基根皮苷生成率较大的三个因素，正效应的取高水平，负效应的取低水平。

4.根据权利要求1、2、3所述的方法，其特征在于：最佳因素组合处于第1组与第2组之间；根皮苷消耗率和3羟基根皮苷生成率对底物根皮苷浓度和粗酶浓度呈负效应，与反应时间呈正效应；但时间延长会影响实际生产产率，室温下根皮苷的水中溶解度不大；考虑到实际操作和生产成本等问题，确定的实际取值为根皮苷浓度1.20mM~1.50mM，转化时间5h ~6.0h，粗酶浓度13.0 U*mL^-1~15 U*mL^-1；按此条件进行验证性实验，得到3-羟基根皮苷的摩尔转化率为92.5%±0.525% 。

5.根据权利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于：应用 Design Expert 8. 0 软件对试验数据进行多元回归分析，得一次多元回归方程：Y=0.72 – 0.099*X₁ + 0.086 * X₂ –0.075 *X₃ (p=0.0109,R²=0.4926)；得二次多元回归Y=0.88-0.099X₁+0.086X₂-0.075X₃-0.015X₁X₂+0.034X₁X₃-0.009X₂X₃-0.045X₁²-0.11X₂²-0.083X₃²； 3-羟基根皮苷转化率均显著；模型回归方程具有显著意义，失拟项结果不显著，说明所选用的回归方程良好；R²=0.9153，精确度10.517，标准偏差0.074，变异系数10.36。