[发明专利]一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组、探针和试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物、探针和试剂盒及其应用。本发明通过嗜水气单胞菌特定的保守区域设计筛选得到引物和探针的最佳组合，其检测特异性好，灵敏度高，检测效果稳定；而且与五种其他病毒相互交叉检测，无干扰信号产生，表现出良好的特异性。基于本发明所建立的RPA引物、探针，设计得到检测试剂及检测试剂盒，对于嗜水气单胞菌检测灵敏度为500pg/μL，检测灵敏度比PCR方法高10倍，检测时间仅需20min，大大缩短了检测时间。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物、探针和试剂盒及其应用。

背景技术

嗜水气单胞菌是气单胞菌的一种，该菌普遍存在于水体环境中，是鱼类气单胞菌感染最主要的病原之一，也是鱼类细菌性败血病的主要原因之一。嗜水气单胞菌，在感染鱼类的同时，还能感染人类等哺乳动物以及两栖类、爬行类动物，导致痢疾、坏死性筋膜炎、败血症等疾病，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。

嗜水气单胞菌存在多种毒力因子，包括黏附因子、内毒素和外毒素。嗜水气单胞菌的脂多糖(LPS)等内毒素可引起宿主的异常免疫反应，造成系统性炎症，即败血症或内毒素休克。此外，嗜水气单胞菌还可以产生大量细胞溶解性毒素和细胞毒性肠毒素等外毒素，如α-溶血素、β-溶血素、Ⅱ型分泌性成孔毒素Act、气单胞菌热不稳定细胞毒性肠毒素Alt和热稳定细胞毒性肠毒素Ast等。

由于嗜水气单胞菌广泛存在于水环境中，我国主要淡水养殖水产品，如草鱼、鲫鱼、鲢鱼、鲤鱼、罗非鱼、虹鳟、对虾、蛙类、龟鳖类等种均有感染报道。由于人类等哺乳动物也是嗜水气单胞菌易感染宿主，因此，如果食用了携带有嗜水气单胞菌的水产品将会给人类健康带来巨大的风险。

目前，嗜水气单胞菌的主要检测方法有：细菌的分离鉴定、间接免疫荧光检测、间接ELISA检测和PCR检测方法。但是目前常见的嗜水气单胞菌检测方法的检测时间较长，且均需要恒温培养箱、荧光显微镜、酶标仪、PCR仪等大型仪器设备完成检测，因此，很难实现对水产品的快速现场检测的实际需求。

因此，基于现有技术中对于水产品快速检测嗜水气单胞菌的成本及技术缺陷，亟需一种能实现快速、高效、准确的检测试剂及检测试剂盒，以满足实际生产需求。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组；

本发明的另一目的在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA探针；

本发明的另一目的在于提供一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供上述RPA检测试剂盒在嗜水气单胞菌检测中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于检测嗜水气单胞菌的RPA引物组，该RPA引物组的序列包括上游引物F和下游引物R；

其中，上述上游引物F选自：

1F：5’-ATCAATCCTGTTACCGGAGAAATACCAA-3’(SEQ ID NO:1)；

2F：5’-GAAATACCAACCTTGTCAGCTCTGGATA-3’(SEQ ID NO:2)；

4F：5’-CAATCACAGCCAATATGTCGGTGAAGAC-3’(SEQ ID NO:3)；

5F：5’-CTACAAGGCTGACATCTCCTATCCCTATGA-3’(SEQ ID NO:4)；

6F：5’-AATACCTGGTGTTACCCGATCAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO:5)；