[发明专利]一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法

说明书

本发明公开了一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，包括如下步骤：（1）制备抗海蛇毒血清层析流穿液，包括：获得血浆；胃蛋白酶消化；硫酸铵第一次沉淀；硫酸铵第二次沉淀；板框压滤；明矾吸附；板框压滤；上清液超滤浓缩脱盐；离子交换柱层析；收集层析流穿液；（2）控制纳米膜过滤的环境温度为20‑28℃，将层析流穿液配制成一定浓度、一定处方的溶液；（3）按照步骤（2）的条件进行纳米膜过滤。本发明对抗海蛇毒血清工艺过程的层析流穿液进行纳米膜过滤除病毒，多次试验获得最佳条件，增加纳米膜过滤的通量，大大降低生产成本，提高抗海蛇毒血清制品去除病毒效率，加快纳米膜过滤在抗海蛇毒血清生产中的应用。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法。

背景技术

毒蛇咬伤常见于亚热带和热带地区。在亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲的农村地区，毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题，我国的蛇伤发病呈现出逐年增多的趋势。

海蛇毒，成分复杂，含有多种蛋白，主要包括磷脂酶A₂、三指毒素、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、血管内皮生长因子、蛇毒因子、蛋白酶抑制剂、磷脂酶B等。海蛇毒的组成成分与海蛇咬伤后的临床症状有直接关系，包括肌肉麻痹、呼吸麻痹、肌肉损伤等。

世界卫生组织(WHO)强调抗蛇毒血清是蛇伤的唯一有效的解毒药（WHO:Guidelines for the management of snakebites）。抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的高效、特效药物，一般认为在被毒蛇咬伤后应立即注射同种蛇毒抗血清以达到最佳中和治疗效果。在明确毒蛇种类后，采取相应的救治措施，迅速使用抗蛇毒血清中和体内蛇毒，防治可能发生的并发症。由于毒蛇咬伤如不及时有效救治常致人死亡，针对本文所述海蛇毒，应用抗海蛇毒血清进行治疗。

抗海蛇毒血清是利用脱毒的海蛇毒素免疫马匹，所得血浆经胃蛋白酶消化、硫酸铵沉淀、明矾沉淀、超滤等纯化步骤得到的马抗海蛇毒免疫球蛋白。为了生产出治疗海蛇毒中毒的特效药抗海蛇毒血清，需要对海蛇毒进行实验鉴定，以便更好的对海蛇毒进行质控。

由于抗海蛇毒血清为来源于马血浆的制品，为提高生物制品的安全性，CFDA（中华人民共和国国家食品药品监督管理总局）要求生产工艺具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应用特定的去除/灭活病毒方法。目前国内外对人血液成分及血液制品的病毒灭活与去除方法有详细的研究，但至今FDA（美国食品药品监督管理局）、EMEA（中东、非洲;和欧洲药品审评局）和CFDA没有传统生产工艺抗血清的具体法规可依。鉴于动物来源的制品存在人畜共患病毒，因此有必要对采集的马血浆在生产过程中进行可能存在的病毒灭活/去除处理并进行工艺验证。可借鉴人源血液制品的病毒灭活/去除方法，如（1）膜过滤法，即根据膜孔径大小去除病毒，不影响制品质量，可去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒，成本较高；（2）巴氏加热法，采用60℃，10h加热处理，能有效灭活HBV、HCV、HIV等病毒，但可能导致对制品中某些成分的不良影响甚至破坏，且耗时长，故不适合大规模生产应用；（3）低pH孵放法，低pH可使病毒表面的细胞抗原电荷发生改变，蛋白质的空间结构发生不可逆的变性，从而使病毒丧失与细胞受体结合的能力，不能侵染细胞，能灭活几种脂包膜病毒，一般采用pH＜4，30-37℃ 20 h。方法较简便，可作为生产过程终端处理，但长时间低pH条件下，对产品有一定的影响；（4）有机溶剂/去污剂（S/D）法，操作简单、经济、适用面广，特别是对血液制品效果良好。如磷酸三丁脂（TNBP）和非离子化的去污剂；Triton X-100或吐温-80结合可以灭活脂包膜病毒，但对非脂包膜病毒无效。