[发明专利]一种漆酶环境激素电化学传感器的制作方法

权利要求书

1.一种漆酶环境激素电化学传感器的制作方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：准备仪器和试剂：使用的主要仪器和设备包括pH计、Milli-Q 超纯水系统、数显智能控温磁力搅拌器、数控超声清洗器、电化学工作站、台式高速冷冻离心机，使用的主要试剂包括Nafion®全氟磺酸离子交换树脂（5 wt.%）、羧基化多壁碳纳米管（COOH-MWCNTs）、双烯雌酚（Dienestrol，DIES）、无水乙酸（CH₃COOH）、无水乙酸钠（CH₃COONa）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）、多巴胺（DA）、抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、葡萄糖（Glc）、无水乙醇（EtOH），其他材料包括Ag/AgCl电极、铂丝、玻碳电极；

步骤2：制备乙酸盐缓冲液：分别用超纯水配置0.1 M的乙酸溶液与0.1 M乙酸钠溶液，将pH计探头插入到0.1 M的乙酸钠溶液中，然后将0.1 M乙酸溶液缓缓加入0.1 M的乙酸钠溶液中，边加边搅拌，分别得到pH值4.0、4.5、5.0、6.0的乙酸缓冲液；

步骤3：制备磷酸盐缓冲液：分别用超纯水配置0.1 M的磷酸二氢钠溶液与0.1 M磷酸氢二钠溶液，然后将两者溶液按比例混合，搅拌均匀后，由pH计测量分别得到pH为7.0、8.0的磷酸盐缓冲液；

步骤4：制备双烯雌酚母液：用分析天平称取0.00266g双烯雌酚溶于5 ml无水乙醇中，避光保存于-20℃冰箱中备用；

步骤5：制备Nafion溶液：5%的Nafion溶液用无水乙醇稀释到0.5%，在4℃冰箱中避光保存备用；

步骤6：漆酶生物传感器制备：所用工作电极为Lac2/COOH-MWCNTs/Nafion修饰电极，电极制作方法为：将COOH-MWCNTs、漆酶（Lac2）和0.1%的Nafion混合搅拌均匀，溶液达到稳定状态后取7 μL该溶液滴涂到预处理过的玻碳电极表面，在室温下干燥后放入温度为4 ℃的冰箱中保存备用；

步骤7：对双烯雌酚的检测：在电化学检测时，用移液枪吸取不同体积的双烯雌酚母液（2 mM）加入到0.1 M的乙酸盐缓冲液（pH6.0）中，使电解液中双烯雌酚的浓度分别为：0.2 μM、0.3 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、5 μM、8 μM、10 μM，在已优化的条件下，用电化学工作站扫描得到循环伏安图，记录氧化峰电流值，然后用Origin2018软件拟合出双烯雌酚浓度与峰值电流的线性关系，并计算出检测限，所有数据均为3次平行实验的平均值，图中误差线为3次平行实验的标准差；

步骤8：干扰实验：在含有5 μM双烯雌酚的乙酸盐缓冲液（0.1 M，pH6.0）中分别加入50μM的多巴胺，50 μM的抗坏血酸，50 μM的尿酸和500 μM的葡萄糖，作为电化学检测的电解液，在已优化的条件下，用电化学工作站扫描得到循环伏安图，记录氧化峰电流值；

步骤9：实际牛奶样品检测：样品预处理：准确量取牛奶样品1 mL置于5 mL具塞塑料离心试管里，再加入2 mL乙醇，旋涡震荡混匀，超声辅助提取10 min，静置30 min以沉淀蛋白质，以1000 r/min速度离心5 min，吸出上清液转移至离心管里封存，在残渣中加入1 mL乙醇，超声辅助提取10 min，1000 r/min离心5 min，上清液转与第一次上清液合并；测试方法：采用加标回收实验法测试所制备生物传感器的实际应用性能，在牛奶样品中加入三种浓度（1 μM、2 μM、5 μM）的双烯雌酚，以上述方法进行样品预处理，然后在已优化的条件下进行循环伏安扫描，并记录其氧化峰电流，用开发的漆酶电化学生物传感器在牛奶中没有检测到双烯雌酚，然后分别加入三种浓度的双烯雌酚进行检测，回收率在98.25%~103.60%，相对标准偏差（RSD）均小于5%，表现出高灵敏度和高精确度，结果表明，本课题开发的漆酶生物传感器可以用于实际牛奶样品检测。

2.根据权利要求1所述的一种漆酶环境激素电化学传感器的制作方法，其特征在于：所述在步骤1中，所有药品都为分析纯，使用前未经进一步纯化，所有用水都为去离子水。