[发明专利]一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明属纳米材料与肿瘤学技术领域，公开了一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用，复合外泌体为EV‑T抗癌小分子，其表面携带促肿瘤凋亡蛋白TRAIL，内部包裹抗癌小分子；先以表达人TRAIL基因的病毒载体转染人的外泌体的细胞资源，获得稳定高表达TRAIL的基因工程化间充质干细胞，标记为MSC‑flT；然后从MSC‑flT培养液中提取细胞分泌的外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体，标记为EV‑T；再将抗癌小分子包裹进EV‑T中制得。本发明的制备工艺简单、高效、成本低；复合外泌体用于抗肿瘤治疗效果显著，药物用量低且无毒副作用，为临床治疗癌症提供了纳米药物策略。

技术领域

本发明属纳米材料与肿瘤学技术领域，更具体地，涉及一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

众所周知，癌症已成为人类健康的最大威胁之一。尽管人们对癌症研究已取得了许多重大突破，但是绝大多数癌症的临床治疗效果仍然不理想。因此，亟需新的有效且安全的治疗方法。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL(Tumour Necrosis Factor-relatedApoptosis-Inducing Ligand)，是具有凋亡诱导活性的肿瘤坏死因子超家族新成员，能够快速诱导癌细胞大量凋亡，而对正常细胞无影响，在癌症治疗领域具有广泛的应用前景。TRAIL与细胞膜表面的死亡受体4(DR4)和5(DR5)结合可征募胞浆内接头蛋白Fas死亡结构域相关蛋白(FADD)和半胱天冬酶原8(Procaspase-8)，形成一个死亡诱导信号复合体DISC(Death-inducing signaling complex)，从而引发Procaspase-8激活进而诱导Procaspase3激活，然后引起细胞凋亡。文献表明，肿瘤细胞相对于正常细胞而言，其DR4/DR5表达水平较高，而正常组织除了DR4/DR5表达水平很低或不表达之外，往往还表达诱骗受体DcR1/2，从而躲避TRAIL对其产生的毒副作用。TRAIL高效特异性杀死癌细胞的特点吸引了人们广泛开展其临床应用研究。然而，迄今为止，重组可溶型TRAIL(rTRAIL)的临床试验效果并不理想。主要原因在于广泛存在肿瘤和癌症对rTRAIL的抗性。此外，rTRAIL在体内不稳定，半衰期只有30分钟，生物利用度低。这些缺点导致其临床效应不好，极大地限制了其临床应用。

间充质干细胞(MSC)是一类具有自我复制能力的多潜能成体干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经等多种组织细胞。此外，干细胞还具有肿瘤归巢的靶向迁移能力。近年来，随着对间充质干细胞研究与应用的深入，已发现其大量分泌细胞外囊泡(外泌体和微囊泡)，而外泌体在多种疾病模型中具有可与细胞匹配的活性和治疗潜力，并且可用作一种天然的生物纳米载体，具有细胞所没有的独特优势。包括；1)可携带膜结合的全长TRAIL(Full length TRAIL，FlT)，这是已经发现的优于rTRAIL的活性更高的分子；2)免疫原性无或极低，进入体内后不会引起免疫反应；3)具有双层磷脂膜结构，可以保护所携带的分子，避免血液循环系统中酶的降解；4)30～200nm的纳米尺度，赋予其很好的组织渗透性，比如良好的透血脑屏障能力；5)良好的稳定性，可在-20℃或-80℃长期贮存；6)多重载药能力，可同时载送亲脂和亲水药物；7)一定的肿瘤靶向性，可提高药物在肿瘤部位的富集浓度。因此，用外泌体载药既能够克服rTRAIL体内不稳定性，又能增强其作用效率，还可通过联用致敏药物解决TRAIL的耐药性问题，有望创造一种高效且安全的新型生物纳米药物。