[发明专利]一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述复合外泌体为EV-T抗癌小分子，其表面携带促肿瘤凋亡蛋白TRAIL，内部包裹抗癌小分子；该复合外泌体是先以表达人TRAIL基因的病毒载体转染人的生产外泌体的细胞资源，获得稳定高表达TRAIL的基因工程化间充质干细胞，标记为MSC-flT；然后采用外泌体制备的金标准-差速结合超速离心法，从MSC-flT培养液中提取细胞分泌的外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体，标记为EV-T；再将抗癌小分子包裹进EV-T中制得。

2.根据权利要求1所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述复合外泌体中促肿瘤凋亡蛋白TRAIL的浓度为0.5～4ng/mL；所述抗癌小分子的浓度为10～80nM；所述复合外泌体储存在-70～-85℃中。

3.根据权利要求1所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述人的外泌体的细胞资源为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘、羊水、羊膜间充质干细胞、人胚肾细胞、心肌细胞、巨噬细胞、T细胞或肿瘤相关成纤维细胞中的一种以上。

4.根据权利要求1所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述抗癌小分子为化学合成药物、免疫治疗药物、天然活性分子或核酸类药物中的一种以上。

5.根据权利4要求所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述的化学合成药物为Dinaciclib，SNS-032、Flavopiridol或阿霉素中的一种以上；所述的免疫治疗药物为DR4/5单克隆激动抗体或/和PD-1/PD-L1单克隆抗体；所述的核酸类药物为mRNA、siRNA、shRNA、lncRNA或micro RNA；所述天然活性分子为番茄红素或/和紫杉醇。

6.根据权利要求1所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述的病毒载体为慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。

7.根据权利要求1所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，其特征在于，所述EV-T的粒径为30～200nm。

8.根据权利要求1-7任一项所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1.以表达人TRAIL基因的病毒载体转染人的外泌体的细胞资源，获得稳定高表达TRAIL的基因工程化间充质干细胞，标记为MSC-flT；

S2.采用外泌体制备金标准-差速结合超速离心法，从MSC-flT培养液中提取细胞分泌的外泌体，得到高纯度表达携带TRAIL的外泌体，标记为EV-T；

S3.将抗癌小分子包裹进EV-T中，得到载有促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体，即EV-T抗癌小分子；所述复合外泌体的表面携带促肿瘤凋亡蛋白TRAIL，内部包裹抗癌小分子。

9.根据权利要求8所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述包裹的载药方法为超声法、膜穿孔法、电穿孔法或共孵育法。

10.权利要求1-7任一项所述的负载促肿瘤凋亡蛋白和抗癌小分子的复合外泌体在制备抗肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为在人肺癌、胸膜间皮瘤、肾癌、神经胶质瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌或黑色素瘤中对TRAIL敏感和高抗性的细胞。