[发明专利]一种纳米-细菌的杂合体系的制备方法

说明书

本发明公开了一种纳米‑细菌杂合体系的制备方法，特点是包括将带有氨基基团的荧光纳米材料溶液和多糖配体溶液混合振荡反应后，加入硼氢化钠溶液，于室温下振荡反应过夜得到多糖配体偶联荧光纳米材料复合物溶液的步骤；将多糖配体偶联荧光纳米材料复合物溶液和光热剂溶液混合后振荡反应得到荧光纳米探针溶液的步骤；最后将荧光纳米探针溶液和工程菌悬液混合后置于摇床中培养一段时间后，得到纯化的纳米‑细菌杂合体系的步骤；优点是兼具肿瘤靶向及光诱导程序性肿瘤治疗功能，有效结合了纳米材料和细菌治疗肿瘤的优势，且不会对细菌本身活性产生影响，肿瘤治疗效率高。

技术领域

本发明涉及一种纳米-细菌的杂合体系的制备方法，尤其是涉及一种兼具肿瘤靶向及光诱导程序性肿瘤治疗功能的纳米-细菌杂合体系的制备方法。

背景技术

近年来，在肿瘤治疗领域，以细菌靶向介导肿瘤治疗的研究掀起了热潮。研究发现部分厌氧菌(如双歧杆菌和芽孢杆菌)和兼性厌氧菌(如沙门氏菌和大肠杆菌)会优先靶向进入肿瘤内部并大量繁殖。细菌治疗相比于传统肿瘤治疗方法存在一定的优势，除了细菌本身无需修饰即可靶向多种肿瘤及转移瘤外，基因工程技术的引入还可将细菌功能化使其表达抗癌分子(如细胞毒性分子、细胞因子和肿瘤抗原等)治疗肿瘤。但是，传统的细菌治疗也存在一定的劣势，如细菌本身的潜在毒性、工程菌表达产物的不可控性以及单一化的细菌治疗疗效有限等问题，有待进一步研究改进。

另一方面，纳米材料载体具有载药率高和可控释药等优点，可在病灶部位实现多模态成像，并且能结合其他肿瘤疗法实施联合治疗。但纳米材料也存在一定问题，如需额外修饰针对特定肿瘤类型的特异性靶向性分子，并且受其本身尺寸、几何形状、成分及表面配体等的影响，纳米药物在肿瘤内部的穿透力有限，致使肿瘤治疗效果欠佳。目前已有研究报道通过将纳米材料聚沉或生长到细菌表面构建完整的“纳米-细菌”杂合体系，但是将纳米材料修饰到细菌表面的做法会在一定程度上损害细菌本身的活性和功能，影响最终的治疗效果。因此，亟需解决米材料有效联合并构建稳定的纳米-细菌杂合体系用于肿瘤治疗的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种兼具肿瘤靶向及光诱导程序性肿瘤治疗功能的纳米-细菌杂合体系的制备方法，该杂合体系有效结合了纳米材料和细菌治疗肿瘤的优势，且不会对细菌本身活性产生影响，肿瘤治疗效率高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种纳米-细菌杂合体系的制备方法，包括下述步骤：

(1)将浓度为25mg/mL的带有氨基基团的荧光纳米材料溶液和浓度为10mg/mL的多糖配体溶液按体积比3:2混合，并于70℃振荡反应4～6小时后，加入2倍混合液体积的浓度为10μg/mL的硼氢化钠溶液，于室温下振荡反应过夜，超滤离心除去多余的未反应上的多糖配体分子，制备得到多糖配体偶联荧光纳米材料复合物溶液；

(2)将步骤(1)制备得到的多糖配体偶联荧光纳米材料复合物溶液和浓度为200 μg/mL的光热剂溶液按体积比2：1混合后，于室温下振荡反应12～24小时，通过超滤离心除去未反应上的光热剂分子，得到荧光纳米探针溶液；

(3)将可在特定温度下表达肿瘤坏死因子TNFα的质粒(pBV220-TNFα)按质粒转化方法转化入细菌中，得到可表达抗肿瘤分子的工程菌，将工程菌活化清洗后溶于生理盐水制成浓度为1.0×10⁷-1.0×10⁸CFU/mL的工程菌悬液；

(4)将步骤(2)制备得到的荧光纳米探针溶液和步骤(3)得到的工程菌悬液按体积比1:5混合后，置于摇床中培养一段时间后，超滤离心去除未结合的荧光纳米探针后，采用0.9wt％的NaCl溶液对细菌离心清洗，得到纯化的纳米-细菌杂合体系。

步骤(1)中所述的荧光纳米材料包括荧光硅纳米颗粒、复合荧光二氧化硅纳米颗粒、II-IV族量子点、荧光纳米微球和荧光纳米碳点中的任一种，所述的多糖配体包括麦芽糖糊精、直链淀粉和葡萄糖聚合物中的任一种。