[发明专利]常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法

说明书

本发明公开了常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；具体包括以下步骤：多重PCR，单碱基延伸反应，质谱检测。本发明的有益效果是：提高了诊断效率，该方法不易交叉污染，试验操作简便，容易标准化，可同时快速检测临床标本中多种常见的呼吸道病毒核酸。通过对常见呼吸道病原体进行高通量鉴别诊断，可以辅助临床及早明确病原体，进行针对性的抗感染治疗具有重要意义。

技术领域

本发明属于呼吸道病原体检测技术领域，尤其涉及一种常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法。

背景技术

呼吸道感染给人类造成了严重的疾病负担，给人类生命健康构成了极大的威胁。能够导致类呼吸道感染的病原体种类繁多。根据2018年WHO发布的统计数据表明，呼吸道感染是全球第四大死因，也是中国5岁以下儿童的第三大死因，占所有死因的19.4％，致病病原包括病毒、细菌、支原体和衣原体，其中儿童患者感染病原中，病毒占比超过70％。中国20-60％的社区获得性肺炎CAP病例无法做出病原学诊断。

常见的呼吸道病原体如副流感病毒1、2、3型，肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道和胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。传统的检测方法为细菌类病原微生物分离培养和间接免疫荧光法检测，但这些方法检测繁琐费时，检测往往不够及时，灵敏度不够，假阳性率偏高，近些年随着分子生物学检测手段的发展和完善，使得及时、快速、准确地诊断呼吸道病原体成为可能。

继2003年SARS冠病毒在全球范围内流行之后，2019年新型冠状病毒突发，疫情四起，截止到2020年5月全世界累计发病近300万，死亡人数30多万，人们依然笼罩在疫情的阴霾之下。病原微生物检测和鉴别诊断再次被推向高潮。在国家发布新冠肺炎诊疗方案中，也重点强调了病原体的检测和鉴别诊断，明确在诊疗方案中提出″新型冠状病毒感染轻型表现需与其它病毒引起的上呼吸道感染相鉴别；新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测；还要与非感染性疾病，如血管炎、皮肌炎和机化性肺炎等鉴别″。

抗感染是呼吸道感染治疗的关键环节，在疾病初期、病原体尚未明确时，常采用广谱抗生素进行经验性治疗，明确病原体之后在转为针对性的抗感染治疗。从现有的治疗策略可以看出，早期明确病原体对抗生素的使用和病原体感染的治疗具有重要的指导意义。

不同种类的肺炎、不同免疫状况的人群其易感病原谱存在显著差异，不能一概而论，如病毒性肺炎多发于5岁以下的儿童，而细菌性肺炎多发于成年人，特别是老年人群更为常见；不同病原体所引起的感染症状又十分相似，常常呈现出″一病多因″的状况，对呼吸道病原体的诊断带了极大困难。

目前诊断呼吸道感染方法主要为病原体分离培养法和血清学检测法，前者通常被认为是诊断的″金标准″，但因细胞分离对培养技术的要求高、耗时长、阳性率低，不利于早期诊断；间接免疫荧光法(IFA)属于血清学检测方法中的一种，该方法方便易行，要求标本含有一定量的抗原和抗体，检测快速，但灵敏度或特异度不高，容易出现假阳性和假阴性，而且由于窗口期的存在，也无法在感染早期进行诊断。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法。

为实现上述目的，本发明所设计的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；具体包括以下步骤：

S1、多重PCR，根据待鉴定位点两端的侧翼序列设计引物，进行多重PCR以扩增待检测位点；