[发明专利]一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用

说明书

本发明公开了一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用。本发明公开的用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法包括：将待测样品在探针溶液中进行处理，得到处理后的样品；探针溶液由溶剂与溶质组成，溶剂为0.1MPBS，溶质及其在探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；2)检测处理后的样品的荧光信号，如处理后的样品发出荧光信号，待测真菌样品含有或候选含有活性氧自由基，如处理后的样品不发出荧光信号，待测真菌样品不含有或候选不含有活性氧自由基。本发明的方法可通过标记细胞凋亡特征以辅助评价菌丝细胞衰老程度，进对菌株活力进行检测，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物化学领域中，一种用于食用菌菌丝的活性氧自由基检测方法及其在菌株活力检测的应用。

背景技术

食用菌菌种质量是食用菌产业健康发展的基础。目前食用菌菌种活力退化机制尚不清楚，并缺乏高效、快速和特异性的食用菌菌株活力检测方法。细胞凋亡与丝状真菌衰老等多种生命过程密切相关。丝状真菌的凋亡具有类似于多细胞生物凋亡的形态学和生物化学特点，如在丝状真菌中绝大多数细胞凋亡反应都依赖于活性氧自由基(ROS)的作用。二氯二氢荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)是一种高效的用于细胞内氧化物质检测的荧光染料。ROS产生时能将DCFH-DA氧化成显示绿色荧光的DCF，并且荧光强度与细胞内ROS含量成正比。在人体、动物和植物细胞中多采用二甲基亚砜(DMSO)溶液将DCFH-DA稀释，再加入到相应的细胞培养溶液中进行孵育，随后对细胞内ROS含量进行定性定量检测。在人体及动物细胞中利用DCFH-DA等荧光探针在进行定量检测时，可直接利用流式细胞仪进行定量检测。由于植物和真菌细胞拥有细胞壁，需要制备原生质体或进行菌丝原位破壁，将菌丝还原成单细胞状态再利用流式细胞仪进行定量分析。细胞壁的去除将导致对菌丝细胞结构造成破坏，诱导菌丝产生凋亡信号，从而影响对凋亡标记准确性及凋亡时期的判断。此外，有报道利用插片培养方式培养丝状真菌菌丝，装载探针后利用荧光显微镜照相，再用ImageJ等软件定量分析荧光量从而定量分析菌丝内ROS含量。但该方法操作繁琐，且由于单视野下菌丝密度不同，对荧光量会造成极大的影响，从而影响检测菌丝内ROS含量精度。同时，食用菌原生质体及插片培养菌丝处于非自然生长状态，菌龄、活力、生长状态等都与原始菌丝体不同，无法对现菌株活力做出精准判断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何定性定量检测真菌活性氧自由基及其活力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了定量检测真菌活性氧自由基的方法，所述方法包括：

1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；

2)分别检测两种处理后的样品的荧光信号，荧光信号强的待测真菌样品的活性氧自由基含量高于或候选高于荧光信号弱的待测真菌样品。

本发明还提供了检测真菌活性氧自由基的方法，所述方法包括：

1)将待测真菌样品在探针溶液中进行处理，得到处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；

2)检测所述处理后的样品的荧光信号，如所述处理后的样品发出荧光信号，所述待测真菌样品含有或候选含有活性氧自由基，如所述处理后的样品不发出荧光信号，所述待测真菌样品不含有或候选不含有活性氧自由基。

本发明还提供了检测真菌活力的方法，所述方法包括：

1)将两种待测真菌样品在探针溶液中分别进行处理，得到两种处理后的样品；所述探针溶液由溶剂与溶质组成，所述溶剂为0.1M PBS，所述溶质及其在所述探针溶液中的浓度为10μM二氯二氢荧光黄双乙酸钠；