[发明专利]一种DNA可逆保护和分离的方法

说明书

本发明提供了一种对DNA进行可逆保护和分离的方法，首先将目标DNA分子的5’端进行磷酸化；然后将5’端腺苷化修饰；终止反应后获得的样品中加入对腺苷化修饰DNA敏感的核酸外切酶消化模板；最后将获得的腺苷化修饰DNA，即分离所得目标DNA，进行测序鉴定等技术分析，所得序列的5’端即为腺苷化修饰位点。本发明提供的方法，填补了现有技术无法精确定位基因组DNA上断裂位点的空白，能够实现对不同长度和不同来源的DNA样品进行断裂位点的定量和定位分析，使用简便，易于操作，而且对样品无特殊要求，准确率高、检测背景影响低、分辨率高。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于对DNA大分子进行可逆保护和分离的方法。

背景技术

DNA分子存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA的完整性对细胞至关重要。然而，多种外界环境和生物体内部的因素都会导致DNA分子的损伤或改变，如紫外线、辐射、致癌性化学物质、细胞自身代谢过程中产生的氧化压力等。这些损伤破坏了基因组的完整性，并威胁着基因组的稳定。现在普遍认为DNA损伤是癌症和许多其他与衰老相关疾病的主要原因，因此对人类健康来说这是一个非常重要的问题。

在诸多DNA损伤类型中，链断裂（Strand break）是公认的对细胞危害最大的一种损伤，因为链断裂可以阻断DNA复制、转录等过程，同时还可能导致重组事件发生。因此，DNA链断裂是生命科学领域的一个研究热点。其中，研究基因组DNA上链断裂发生的位置和规律是理解该类损伤的基础。

目前，在全基因组范围内定位DNA断裂位点的技术主要有两种： Baranello课题组开发的DSB-Seq、SSB-Seq技术和 Philipp Kapranov课题组的SSiNGLe技术。前者使用生物素和地高辛分别标记双链断裂位点和单链断裂位点，然后亲和富集标记的DNA片段并结合二代测序进行分析。SSiNGLe技术在DNA片段化过程中，利用微球菌核酸酶（MNase）消化DNA产生3’磷酸末端，然后通过末端转移酶（TDT）添加PolyA尾来对具有3’羟基末端的DNA断裂位点进行标记捕获，并与二代测序相结合。这两种方法虽然实现了全基因组范围内对DNA断裂位点的定位，但是它们在应用过程中均存在局限性。例如，DSB-和SSB-seq对断裂位点定位的分辨率较低，测序过程中背景高等；而SSiNGLe技术无法检测发生在DNA腺嘌呤（Adenine，A）上的断裂。

因此，鉴于DNA断裂的重要性和目前鉴定技术的局限性，本发明开发了一种通过对目标DNA分子进行可逆保护和分离的方式，实现了低成本、高灵敏度、高分辨率定位DNA断裂位点，并且进一步应用于定位DNA多种类型的损伤和修饰的研究。该技术将极大推动DNA损伤－修复过程、癌症发生机理及预防、药物安全性评估、基因治疗、遗传疾病等领域的科学研究和临床应用。

发明内容

针对现有检测DNA损伤方法背景高、分辨率低、准确率低的问题，本发明提供一种可用于检测DNA损伤的DNA可逆保护和分离的方法，能够高精度定位DNA损伤位点，可以应用于不同长度和不同来源的DNA样品，可以对目标DNA进行单分子、单核苷水平的分离和分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种DNA可逆保护和分离的方法，包括以下步骤：

（1）将DNA分子通过酶处理，获得含5’磷酸化DNA的样品；

（2）将含5’磷酸化DNA的样品解旋获得单链DNA；

（3）将单链DNA进行5’腺苷化标记，获得含5’腺苷化DNA的样品；

（4）使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶对步骤（3）获得的样品进行消化，去除未被5’腺苷化修饰的单链DNA，纯化后获得腺苷化修饰的目标DNA分子；